Estudio del mecanismo de acción citotóxico de un tetranortriterpenoide aislado de Melia azedarach en células de carcinoma colorrectal humano

JORAY M.B.; VILLAFAÑE F; GONZÁLEZ M.L.; PALACIOS S. M.; CRESPO M.I.; BOCCO J.L.; SORIA R.G.; CARPINELLA M. C.

Simposio; IX International Symposium on natural products chemistry and applicaions; 2016

Melia azedarach es una especie naturalizada ampliamente distribuida en Argentina.Previamente en nuestro laboratorio, se aisló a partir del endocarpio de esta planta altetranortriterpeno meliartenin. Tal como fue descripto, este compuesto existe en solución comoparte de una mezcla isomérica (1) junto a su isómero interconvertible 12-hidroxiamoorastatin1.En el presente trabajo, la toxicidad de 1 fue evaluada frente a un panel de célulastumorales constituido por células de leucemia linfoblástica aguda (CCRF-CEM) y de leucemiamieloide crónica (K562) junto a sus respectivas variantes resistentes a multidroga, CEM/ADR5000y Lucena 1; células de carcinoma de pulmón (A549) y dos líneas de carcinoma colorrectal (HCT116y HCT4016). Por otro lado se evaluó su efecto tóxico sobre células mononucleares de sangreperiférica humana. Estos ensayos fueron realizados mediante la técnica de MTT. La línea HCT116presentó la mayor sensibilidad frente a 1 con un valor de IC50 de 0.2 μM por lo que fueseleccionada para llevar adelante los estudios de mecanismo de acción.En una primera instancia, se llevó a cabo el ensayo de supervivencia clonogénica. Ésteevidenció una importante reducción de la capacidad de formación de colonias tras la exposición adiferentes dosis de tratamiento durante un período de 72 h con un valor de IC50 de 0.04 μM.Posteriormente, se realizaron diversos estudios de citometría de flujo. La inducción de muertecelular fue evaluada empleando la tinción SYTOX Red y también por doble tinción con AnexinaV/SYTOX Red. Estos estudios demostraron que la muerte observada estaría principalmenteasociada a un proceso de apoptosis. Por otro lado se estudió el efecto de 1 sobre la progresión delciclo celular en la línea tumoral bajo estudio mediante tinción de ADN con Ioduro de Propidio. Lascélulas tratadas mostraron un retraso en la progresión por la fase S del ciclo celular junto a unincremento de la población hipodiploide (Sub-G1). Estos resultados fueron confirmados medianteestudios de proliferación con análogos de timidina. En base a estos resultados se decidió evaluarla influencia de 1 en la expresión de p53 y p21, proteínas clave en la regulación de la progresióndel ciclo y de la muerte celular en respuesta a agentes genotóxicos. Mediante Western Blot sepudo observar que 1 indujo la expresión de p53 y p21 en HCT116. Para determinar la relevanciade la inducción de estas proteínas en la muerte celular observada se evaluó el efecto citotóxicoselectivo de 1 sobre líneas isogénicas derivadas HCT116 p53 -/- y HCT116 p21 -/-, en comparación con la línea parental HCT116. Las células HCT116 p53 -/- mostraron una marcadaresistencia al tratamiento, confirmando el rol central de p53 en la inducción de muerte celularmediada por 1.En conclusión, los resultados obtenidos permiten delinear el mecanismo molecular de acción en la citotoxicidad ejercida por 1, posicionándolo como potencial candidato anti-tumoral per se o bien como líder para el desarrollo de nuevos agentes con citotoxicidad selectiva para líneas tumorales con expresión normal de p53.