INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Nuevo ligando diseñado a partir de un segmento del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF)
Autor/es:
G. R. BARREDO; S. L. GIUDICESSI; M. C. MARTÍNEZ CERON; S. L. SAAVEDRA; L. FILGUEIRA RISSO; G. MAHLER; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Reunión:
Jornada; Jornadas de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2019
Resumen:
Introducción:El fármaco Bevacizumab (Avastin) es un anticuerpo monoclonal dirigido contra el factor de crecimiento endotelial vascular (vascular endothelial growth factor, VEGF) utilizado en el tratamiento de numerosos tipos de cáncer. Es una IgG recombinante humanizada producida en células de mamífero. Como su administración es parenteral, su pureza debe ser extremadamente alta. En la actualidad, esto se logra por medio de una cromatografía de afinidad (AC) con proteína A inmovilizada. La proteína A es altamente costosa e inestable química y térmicamente, por lo que las matrices de afinidad con dicho ligando son muy costosas y de baja vida útil. Además, para eluir la IgG de la matriz, se necesitan condiciones extremadamente ácidas que son dañinas tanto para el anticuerpo como para el ligando. A diferencia de los ligandos proteicos, los péptidos cortos han demostrado ser ligandos ideales para AC debido a su mayor estabilidad, fácil síntesis y menor costo. Teniendo en cuenta estudios previamente realizados sobre el sitio de interacción entre el Bevacizumab y el VEGF, se diseñaron péptidos cortos para su uso como ligandos de afinidad para la purificación del Bevacizumab.Materiales y métodos:Se diseñaron diversos péptidos, lineales, cíclicos y dendrímeros, en base a la zona de interacción del fragmento Fab del bevacizumab con el VEGF. Para evaluar cualitativamente la interacción de Bevacizumab con los péptidos diseñados, estos se sintetizaron en fase sólida en bolillas de resina ChemMatrix y se pusieron en contacto con Bevacizumab marcado con Texas Red. Aquellos péptidos que resultaron positivos fueron sintetizados en mayor escala en resina Rink-Amide y posteriormente separados de la misma y purificados. Los péptidos purificados se inmovilizaron en agarosa previamente activada y se obtuvieron así matrices de afinidad con los respectivos ligandos peptídicos inmovilizados.Se evaluó la afinidad y capacidad de las matrices diseñadas por medio de isotermas de adsorción en el equilibrio utilizando Bevacizumab puro. Asimismo, se sembraron en las diversas matrices cromatográficas muestras de cultivos clarificados de células CHO productoras de Bevacizumab. Se evaluaron las fracciones obtenidas a través de geles SDS-PAGE.Resultados:Tanto los péptidos lineales, como los cíclicos y los dendrímeros inmovilizados en ChemMatrix adsorbieron al Bevacizumab marcado con Texas Red, por lo que se prepararon matrices de agarosa con los diversos péptidos diseñados. Los mejores resultados se obtuvieron con el péptido lineal. Las isotermas de adsorción demostraron una constante de afinidad entre el bevacizumab y el péptido inmovilizado (Ka) de 2.86 x 106 M y una capacidad máxima de 38 mg de Bevacizumab por ml de matriz cromatográfica. Se ensayó la purificación de muestras de sobrenadante de cultivo de células CHO productoras de Bevacizumab con la columna con el péptido lineal inmovilizado. El Bevacizumab se adsorbió selectivamente a la matriz separándose así de las demás proteínas presentes en el caldo de cultivo celular. A su vez, se lograron optimizar las condiciones de elución utilizando pHs moderados evitando así dañar al biofármaco.Conclusiones:La matriz cromatográfica con el péptido lineal inmovilizado permitió aislar selectivamente al bevacizumab. La capacidad de la matriz resultó superior a las matrices comerciales con proteína A inmovilizada. El ligando peptídico es de menor costo y su mayor estabilidad permite aumentar la vida útil de la matriz. Si bien existen ligandos peptídicos previamente desarrollados, la gran ventaja del presente ligando es la ausencia en su secuencia de aminoácidos proclives a la oxidación como Trp, Met o Cys, aumentando aún más la vida útil de la matriz. Asimismo, se optimizaron condiciones suaves de elución favoreciendo la integridad del biofármaco.
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