INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
DISEÑO DE PÉPTIDOS CÍCLICOS CON AFINIDAD POR BIOMOLÉCULAS
Autor/es:
S. L. GIUDICESSI; J. M. GUREVICH-MESSINA; M. C. MARTÍNEZ-CERON; S. L. SAAVEDRA; G. ACOSTA; R. ERRA-BALSELLS; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
Santa Fe
Reunión:
Simposio; 3º Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014
Institución organizadora:
Saprobio
Resumen:
Los péptidos cíclicos con afinidad por biomoléculas son de gran interés en el desarrollo de fármacos, sistemas de diagnóstico y ligandos para cromatografía de afinidad. Su mayor rigidez estructural en comparación con sus contrapartes lineales permite el diseño de ligandos de mayor afinidad, selectividad y altamente estables. El uso de bibliotecas combinatorias peptídicas del tipo ?una bolilla-un péptido? facilita la búsqueda de péptidos con afinidad por cualquier proteína de interés. La síntesis se realiza por el método dividir-acoplar-recombinar (DAR) que consiste en dividir el soporte sólido en partes iguales, acoplar un aminoácido diferente en cada porción, mezclar las porciones y volver a dividir para el siguiente acople. Esto asegura una representación equimolecular de todos los miembros de la biblioteca combinatoria y en la que cada bolilla de resina tenga una única entidad peptídica. El screening se realiza colocando la proteína blanco marcada en contacto con la biblioteca y seleccionando luego las bolillas positivas. El método ideal para identificar el péptido unido a cada bolilla seleccionada es la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Previamente diseñamos una estrategia de síntesis de bibliotecas basada en unir los péptidos a las bolillas de resina a través del ancla 4-hidroximetil benzoico (HMBA). Se forma así un éster bencílico entre el ancla y el primer aminoácido. Éste es estable durante el screening de la biblioteca y luego se puede romper con vapor de amoníaco para liberar e identificar el péptido por MS/MS. Si bien la secuenciación de péptidos lineales es muy sencilla por MS/MS, los espectros de masa obtenidos a partir del péptidos cíclicos son muy complejos, lo que dificulta su secuenciación inequívoca. El objetivo del trabajo fue el diseño de bibliotecas de péptidos cíclicos para facilitar su identificación por MS/MS. Se plantearon dos estrategias: A) síntesis de bibliotecas de péptidos codificadas y B) bibliotecas con un sitio de apertura en el anillo. Materiales y Métodos Método A, bibliotecas codificadas: la estrategia consistió en: 1) inmovilizar sobre las bolillas de resina ChemMatrix el ancla ácido 4-hidroxilmetilbenzoico (HMBA), 2) acoplar sobre la resina un 10-20% de Fmoc-Ala-OH y 80-90% de Fmoc-Asp[2-fenilisopropil (OPp)]-OH, 3) sobre la resina modificada sintetizar la biblioteca combinatoria por el método DAR, 4) una vez agregados todos los aminoácidos eliminar el grupo Fmoc del amino terminal con piperidina/dimetilformamida (DMF), 5) clivar específicamente el grupo protector del Asp, OPp con solución de ácido trifluoroacético (TFA) 4% en diclorometano (DCM) , 6) ciclar los péptidos en fase sólida a través de la formación de una unión amida entre el carboxilo del Asp y el amino terminal del péptido con benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio hexafluorofosfato (PyBOP), 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt) y diisopropiletilamina (DIPEA), g) clivar los demás grupos protectores de cadenas laterales con TFA-triisopropil silano (TIS)-H2O (95:2.5:2.5). Método B, bibliotecas con sitio de apertura del anillo: el método de síntesis consistió en unir el ancla HMBA a la resina ChemMatrix; luego se incorporó como brazo espaciador Ala-Gly. Sobre el Ala-Gly-HMBA-ChemMatrix resultante se acopló Fmoc-Asp(OPp)-OH. Se siguió con la síntesis de la parte combinatoria de la biblioteca por el método DAR. Para incorporar una unión éster lábil en el ciclo se acopló ácido glicólico y posteriormente una Ala en el N-terminal. Para ciclar se eliminó el grupo protector del Asp (OPp) y se unió el ácido de la cadena lateral del Asp con el amino terminal. Una vez ciclados los péptidos, se eliminaron los demás grupos protectores de las cadenas laterales con TFA-TIS-H2O (95:2,5:2,5). Ambas bibliotecas fueron sometidas al screening. Las bolillas positivas de la biblioteca fueron aisladas y tratadas con vapor de amoníaco para la posterior secuenciación del péptido presente en cada bolilla por MALDI-TOF MS/MS. Resultados y Discusión Con la estrategia A se obtuvo una biblioteca donde cada bolilla de resina tuvo un 80-90% del péptido cíclico y un 20-10% del péptido lineal con la misma secuencia que el cíclico. Éste último sirvió de código para secuenciar el péptido por MALDI-TOF MS/MS. El tratamiento con vapor de amoníaco permitió la separación de la bolillba de resina tanto del del péptido cíclicocomo de su contraparte lineal. La alta sensibilidad del MALDI-TOF MS/MS permitió secuenciar el código lineal de cada bolilla seleccionada y con ello deducir la secuencia del péptido cíclico. La mayor proporción de péptido cíclico con respecto al lineal favoreció la selección de bolillas que contienen los péptido cíclicos con afinidad por la proteína de interés El tratamiento con vapor de amoníaco en la biblioteca B permitió simultáneamente abrir el ciclo y separar el péptido de la resina. De esta manera se pudo identificar fácilmente el péptido presente en cada bolilla de resina a través de la secuenciación por MALDI-TOF MS/MS de los péptidos linealizados. Conclusión Ambas metodologías desarrolladas permitieron identificar las secuencias de los péptidos que interaccionaron con las biomoléculas. A diferencia de otras metodologías previamente publicadas, en las presentes estrategias no se requiere del uso de reactivos altamente peligrosos como Pd y CNBr. Debido a la sencillez de su síntesis se puede aplicar en una amplia gama de laboratorios no necesariamente expertos en síntesis orgánica.
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