Ligandos de afinidad peptídicos para la purificación de rhGH presente en leche de vaca transgénica

S. L. SAAVEDRA; M. C. MARTÍNEZ-CERON; S. L. GIUDICESSI; O. CASCONE; S. A. CAMPERI

Ciudad de Buenos Aires, Caballito

Congreso; ETIF 2018; 2018

La hormona de crecimiento humana recombinante (rhGH) se utiliza como tratamiento en diversas enfermedades, particularmente las relacionadas al crecimiento. La rhGH puede ser expresada en la leche de vacas transgénicas con un rendimiento de 5 mg/mL (Salomone et al., 2006), pero la leche es un medio muy complejo por lo que se necesita un método selectivo y eficiente para purificar rhGH a partir de ella.La cromatografía de afinidad permite reducir el número de pasos de un proceso de purificación. Los ligandos peptídicos pueden sintetizarse químicamente a bajo costo y son más estables química y físicamente que otros ligandos.Clackson T. et al. (1998) describieron el sitio de reconocimiento receptor/hormona y definieron los aminoácidos presentes en esa interacción. Por ello, se diseñó un péptido y se evalúo su capacidad como ligando de afinidad: (Ac)GWRIWIPVAC. Finalmente, se estudió la influencia de los triptófanos presentes en la secuencia, ya que son susceptibles a sufrir oxidaciones.Metodologías: Se sintetizaron los péptidos (Ac)GWRIWIPVAC (PWW), (Ac)GFRIWIPVAC (PFW), (Ac)GWRIFIPVAC (PWF) y (Ac)GFRIFIPVAC (PFF) por química Fmoc. Se los inmovilizó para ser utilizados como matrices cromatográficas en la resina Sulfolink®-agarosa. Finalmente, se evalúo el desempeño cromatográfico de cada nueva matriz y se las comparó con PWW. Se sembraron 0,8 mg de rhGH en cada columna. Se utilizó como buffer de adsorción Tris/HCl 50 mM pH 9 y como buffer de elución buffer de fosfatos 20 mM, NaCl 2 M pH 6.1.Resultados:Se adsorbió el 90% de la hormona cuando se realizó la cromatografía con el péptido PWW. Esta matriz fue tomada como referencia.En las condiciones ensayadas PFW adsorbió el 88% y PWF el 76%. En el caso del PFF las condiciones de elución no fueron suficientes para recuperar el total de la proteína, por lo cual se reemplazó el buffer de elución por Tris/HCl 50 mM pH 7.5, NaCl 1M en propilenglicol 25%. Así se pudo recuperar en la fracción de elución el 99% de la proteína sembrada.Conclusiones:Aquellos ligandos en los cuales se reemplazó uno de los triptófanos por una fenilalanina perdieron capacidad de adsorción comparación con PWW. Por otro lado, el cambio de ambos triptófanos por fenilalanina mejoró la adsorción de rhGH, necesitándose condiciones más astringentes para lograr su recuperación total en la fracción de elución. En el futuro se determinarán las constantes de afinidad de ambos péptidos por la rhGH y su desempeño con una muestra real de leche que contenga la hormona para determinar cuál es el mejor candidato para purificarla a partir de leche de vaca transgénica y para ser utilizado a escala industrial.