INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Biosensor de resonancia plasmática de superficie para la evaluación de la afinidad de rhEPO por péptidos seleccionados de bibliotecas combinatorias
Autor/es:
M. C. MARTÍNEZ-CERON; M. TAULÉS; M. M. MARANI; M. ETCHEVERRIGARAY; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
Ciudad Autónoma de Buenos Aires, ARGENTINA
Reunión:
Jornada; X Jornada de Farmacia y Bioquímica Industrial; 2009
Institución organizadora:
Asociación Argentina de Farmacia y Bioquímica Industrial
Resumen:
Introducción y Objetivos. La eritropoyetina recombinante humana (rhEPO) tiene aplicaciones terapéuticas en la anemia asociada con la insuficiencia renal crónica y la anemia inducida por AZT en SIDA. Actualmente su purificación se logra con numerosos pasos cromatográficos, con la consecuente disminución del rendimiento y aumento del costo. La cromatografía de afinidad (AC) permite realizar purificaciones en un solo paso, con alto rendimiento, siempre que se encuentre un ligando de adecuada afinidad y selectividad. Los péptidos cortos son ideales como ligandos por ser económicos, de alta estabilidad y fácil manufactura. En trabajos previos hemos desarrollado un método rápido y de gran sensibilidad para la identificación de péptidos de alta afinidad por proteínas a través del screening de bibliotecas combinatorias peptídicas del tipo “una bolilla un péptido. Estas bibliotecas consisten en millones de péptidos sintetizados en fase sólida donde cada bolilla de resina tiene una sola entidad peptídica. La metodología desarrollada se utilizó para la identificación de ligandos adecuados para la purificación de la rhEPO. Para la evaluación de la afinidad de los péptidos seleccionados por rhEPO se utilizó un biosensor de resonancia plasmática de superficie Biacore T100, que es la herramienta más sofisticada para medir la interacción entre moléculas. Se basa en inmovilizar en un chip una de las moléculas y luego pasar una solución de la otra molécula para medir la interacción de las mismas por un fenómeno denominado resonancia plasmática de superficie (SPR). Materiales y Métodos. Se sintetizó una biblioteca combinatoria de octapéptidos utilizando la química Fmoc y el método dividir-acoplar-recombinar, que permite obtener una única entidad peptídica por bolilla de resina. Para el screening se puso en contacto la biblioteca con la rhEPO conjugada con el colorante fluorescente Texas Red. Se aislaron las bolillas fluorescentes y los péptidos de las bolillas seleccionadas se secuenciaron por tandem MALDI-TOF MS. Se puso a punto la medida con el Biacore T 100 utilizando chips de streptavidina (SA) y péptidos descriptos con afinidad por la SA. Para analizar la afinidad de los péptidos resultantes del screening se marcó la rhEPO con biotina y se la inmovilizó en un chip de SA. Se analizó la afinidad de los diferentes péptidos seleccionados con el Biacore T100. Resultados. En general del screening surgen numerosas bolillas positivas. Los péptidos de todas las bolillas se identificarán por tandem MALDI-TOF MS. Sin embargo, es altamente costoso sintetizar matrices cromatográficas con cada péptido seleccionado para evaluarlos como posibles ligandos cromatográficos. Es por ello que se diseñó una estrategia de análisis basada en SPR. Para abaratar el análisis teniendo en cuenta los costos de los chips, se inmovilizó la rhEPO en lugar de cada péptido. La inmovilización directa de rhEPO en los chips comerciales de carboximetil celulosa (CM) no fue adecuada debido al bajo pI de la rhEPO. Es por ello que se la inmovilizó en un chip de SA luego de marcarla con biotina. Algunos de los péptidos resultantes del screening fueron analizados. No todos los péptidos evaluados presentaron buena afinidad por rhEPO, esto puede deberse a la presencia de falsos positivos debido a la interacción del Texas Red con péptidos de la biblioteca. Se hallaron péptidos con muy buena afinidad por rhEPO en un rango de Kd de 10-5 - 10 -6 M.   Conclusiones. La técnica diseñada permitió medir la afinidad de unos pocos ng de péptido en forma sencilla descartando los falsos positivos y determinando cuáles de todos los péptidos resultantes del screening tienen mayor afinidad. Sólo estos últimos son luego sintetizados en mayor escala para ser inmovilizados en matrices cromatográficas y evaluarlos como candidatos para purificación de rhEPO por AC.
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