INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Métodos alternativos para aumentar la estabilidad de los péptidos frente a proteasas y peptidasas
Autor/es:
S. L. GIUDICESSI; M. C. MARTÍNEZ-CERON; O. CASCONE; R. ERRA BALSELLS; F. ALBERICIO; S. A. CAMPERI
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Congreso; 8º CONGRESO Y EXPOSICIÓN PARA LA CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA, BIOTECNOLÓGICA Y VETERINARIA; 2014
Institución organizadora:
ETIF
Resumen:
La cromatografía de afinidad (AC) se basa en un reconocimiento molecular entre la proteína de interés y un ligando inmovilizado sobre un soporte. Dentro de los ligandos posibles, los péptidos cortos son ideales ya que pueden ser sintetizados a un bajo costo y en forma aséptica bajo normas GMP. Al no requerir de una estructura terciaria específica para mantener su actividad biológica, son más estables que otros ligandos. Sin embargo, una de las desventajas que presentan es su inestabilidad frente a proteasas y peptidasas comúnmente presentes en los caldos de cultivo de células productoras de biofármacos recombinantes. Es por ello que se han diseñado estrategias para maximizar la resistencia de los péptidos a su degradación, preservando o aún aumentado su afinidad y selectividad. Algunas de las estrategias son la amidación del carboxilo terminal,la acetilacióndel amino terminal, la metilación del nitrógeno amida, la ciclación de los péptidos y el cambio de quiralidad de los aminoácidos mediante el uso de D-aminoácidos. El objetivo de este trabajo fue analizar y comparar la estabilidad y afinidad por la proteína eritropoyetina humana recombinante (rhEPO) de cinco péptidos:(I) (Ac)-F-H-H-F-A-H-A-K-NH2, (II) (Ac)-f-h-h-f-a-h-a-k-NH2, (III) (Ac)- a-h-a-f-h-h-f-k-NH2 y (IV) cyclo(1,8)-F-H-H-F-A-H-A-D-K-NH2. Los péptidos se sintetizaron en fase sólida empleando la química Fmoc en resina Rink-Amide-MBHA, utilizando L- y D-aminoácidos con los grupos laterales protegidos. Para la síntesis de los péptidos (II) y (III) se utilizaron D-aminoácidos. Para el péptido (IV) se utilizó el aminoácido Asp(ODamb), cuyo grupo protector se cliva con hidrazina 2%, y posteriormente se procede al ciclado del mismo. Todos los péptidos se inmovilizaron en la resina de NHS-Sepharose, y la eficiencia de la inmovilización se siguió por HPLC. Se analizó la afinidad por la rhEPO mediante isotermas de adsorción en el equilibrio y cromatografías de afinidad. Para el estudio de estabilidad se trataron los diferentes péptidos con quimotrispina y tripsina, y se tomaron muestras a diferentes tiempos. Los péptidos sintetizados y los resultados obtenidos en el estudio de estabilidad se analizaron a su vez por espectrometría de masa MALDI-MS/MS. Los resultados mostraron que la mayor afinidad por la rhEPO se obtuvo con los péptidos (I), (III) y (IV), cuyas isotermas presentaron una Kd de1,9 ±0,1, 1,78±1 y 1,7±0,6 respectivamente. Por otro lado, los espectros de masa MALDI mostraron que el péptido (I) presentó menor estabilidad frente a las diferentes enzimas, ya que se observaron señales correspondientes a las digestiones al poco tiempo de incubación, mientras que en el espectro del péptido (III) no se observaron señales de digestión hasta pasados los 60 minutos de incubación. Los resultados muestran una estrategia simple y eficiente para aumentar la estabilidad de ligandos de afinidad peptídicos, sin alterar la afinidad por la proteína de interés. Las estrategias presentadas son sencillas y pueden ser empleadas tanto en laboratorios químicos como en biológicos, siendo posible también su empleo a escala industrial.
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