Diseño de bibliotecas combinatorias cíclicas para facilitar su secuenciación por MALDI MS/MS

J. M. GUREVICH-MESSINA; S. L. GIUDICESSI; M. C. MARTÍNEZ-CERON; G. ACOSTA; R. ERRA-BALSELLS; O. CASCONE; F. ALBERICIO; S. A. CAMPERI

Buenos Aires

Congreso; 8º CONGRESO Y EXPOSICIÓN PARA LA CIENCIA Y TECNOLOGÍA FARMACÉUTICA, BIOTECNOLÓGICA Y VETERINARIA; 2014

ETIF

Los oligopéptidos con afinidad por proteínas blanco tienen gran aplicación en el desarrollo de fármacos, sistemas diagnóstivos y en purificación de proteínas. Entre los oligopétidos, los oligopéptidos cíclicos presentan gran interés debido a su mayor resistencia a proteasas y a que suelen presentar mayor afinidad que sus contrapartes lineales. El uso de bibliotecas combinatorias peptídicas del tipo ?una bolilla-un péptido? facilita la búsqueda de péptidos con afinidad por cualquier proteína de interés. En las mismas están representadas todas las combinaciones de los AA utilizados y cada bolilla de resina representa una única entidad peptídica. El screening se realiza colocando la proteína blanco marcada en contacto con la biblioteca y seleccionado luego las bolillas positivas. El método ideal para identificar el péptido unido a cada bolilla seleccionada es la espectrometría de masas en tándem (MS/MS). Previamente diseñamos una estrategia de síntesis de bibliotecas basada en unir los péptidos a las bolillas de resina a través del ancla 4-hidroximetil benzoico (HMBA). Se forma así un éster bencílico entre el ancla y el primer AA. Éste es estable durante el screening de la biblioteca y luego se puede romper con vapor de amoníaco para liberar e identificar el péptido por MS/MS. Si bien la secuenciación de péptidos lineales es muy sencilla por MS/MS, la secuencia de péptidos cíclicos es difícil de deducir debido a su compleja fragmentación. El objetivo del presente trabajo fue el diseño de bibliotecas de péptidos cíclicos con un sitio de apertura en el anillo de manera de poder linealizar el péptido previo a su secuenciación por MS/MS. Para ello se incorporó un éster glicol amídico luego de las posiciones combinatorias de la biblioteca acoplando ácido glicólico. El método de síntesis consistió en unir el ancla HMBA a la resina ChemMatrix; luego se incorporó como brazo espaciador Ala-Gly. Sobre el Ala-Gly-HMBA-ChemMatrix resultante se acopló Fmoc-Asp[2-phenylisopropyl (OPp)]-OH. Se siguió con la síntesis de la parte combinatoria de la biblioteca por el método dividir, acoplar y recombinar que consiste en dividir el soporte sólido en partes iguales, acoplar un AA diferente en cada porción, mezclar las porciones y volver a dividir para el siguiente acople. Luego de la parte combinatoria se acopló ácido glicólico y posteriormente una Ala en el N-terminal. Para ciclar se eliminó el grupo protector del Asp (OPp) y se unió el ácido de la cadena lateral del Asp con el amino terminal. Por lo general el ciclado de péptidos es una tarea compleja, siendo el rendimiento dependiente tanto del tamaño del ciclo, de la secuencia del péptido y de la mezcla de reactivos utilizados para ciclar, por lo que se ensayaron diferentes mezclas para optimizar el ciclado. Una vez ciclados los péptidos, se eliminaron los demás grupos protectores de las cadenas laterales. Luego de ser sometidas al screening, las bolillas positivas de la biblioteca fueron aisladas. Para clivar las uniones ésteres se trataron las bolillas con vapor de amoníaco, con lo cual simultáneamente se abrió el anillo y se separó el péptido de cada bolilla de resina. De esta manera se pudo identificar fácilmente el péptido presente en cada bolilla de resina a través de la secuenciación por MALDI-TOF MS/MS de los péptidos linealizados.