DISEÑO DE LIGANDOS PEPTÍDICOS PARA LA PURIFICACIÓN DE HORMONA DE CRECIMIENTO HUMANA RECOMBINANTE A PARTIR DE LECHE BOVINA

S. L. SAAVEDRA; M. C. MARTÍNEZ-CERON; S. L. GIUDICESSI; O. CASCONE; S. A. CAMPERI

Congreso; ETIF 2016; 2016

Comité Científico de ETIF 2016

La hormona de crecimiento humana (hGH) es una proteína que actúa estimulando el crecimiento y la reproducción y regeneración celular [1], entre otros procesos. Desde mediados del siglo XX se la usa para el tratamiento del hipopituitarismo y de otros fenómenos relacionados y, previo al advenimiento de la tecnología recombinante, se purificaba a partir de la hipófisis de cadáveres, lo que tuvo como consecuencia varios casos de la enfermedad de Creutzfeld?Jacob (mal de la vaca loca) [2, 3].Gracias a la sencillez y al conocimiento sobre el mismo, y debido a la falta de modificaciones post-traduccionales de la proteína, el organismo elegido en la actualidad para la producción de hormona recombinante (rhGH) a nivel industrial es Escherichia coli. Sin embargo, el alto nivel de expresión proteico obtenido hace que la hormona forme mayoritariamente cuerpos de inclusión, complicando su purificación debido a la presencia de algunos contaminantes, entre ellos moléculas inactivas del producto de interés [2, 4].Existen otros sistemas de expresión heterólogos de la hormona, y entre ellos se encuentra la producción en leche de vaca transgénica. Se han reportado valores de hasta 5 g/l de rhGH provenientes de la leche de un único animal, por lo que se estima que manteniendo el mismo ritmo de producción, y una vez que los bovinos alcancen su madurez, se podría cubrir el requerimiento de hormona a nivel mundial con solo 15 vacas [5]. Sin embargo, la leche es una fuente rica en proteínas, por lo que la purificación del producto de interés puede requerir varios pasos de purificación [6], disminuyendo el rendimiento y aumentando el costo del proceso.Los procesos cromatográficos por afinidad permiten una reducción del número de pasos de purificación al introducir una interacción específica entre el ligando y el producto de interés. Dentro de la variedad de ligandos con afinidad disponibles, los péptidos cortos presentan la ventaja de ser estables y resistentes a la acción de proteasas, pueden sintetizarse a bajo costo, en gran cantidad, y bajo normas GMP, y su interacción es lo suficientemente moderada como para poder eluir la proteína de interés en condiciones suaves [7].Con el objetivo de purificar rhGH a partir de leche de vaca transgénica, se seleccionaron y analizaron distintos péptidos sintéticos con afinidad por la proteína.Se sintetizó una biblioteca combinatoria de péptidos en fase sólida mediante el método dividir-acoplar-recombinar, el cual permite que cada bolilla de polímero sintético represente una única entidad peptídica. Una vez sintetizada la biblioteca, se sometió una porción de la misma a un screening con rhGH unida a biotina, y se reveló mediante el sistema estreptavidina-peroxidasa con α-cloronaftol y H2O2. Las bolillas positivas para la interacción, visualizadas por su coloración violeta, fueron aisladas manualmente, lavadas y analizadas mediante espectrometría de masas MALDI-TOF-TOF para determinar su secuencia peptídica. Una vez obtenidas varias secuencias, se realizó una comparación entre las mismas para determinar frecuencia de aparición de aminoácidos por posición en el péptido y la presencia de patrones.Se seleccionaron seis péptidos (G1-G6) los cuales fueron sintetizados y sometidos nuevamente a screening para determinar que no fueran falsos positivos. Sólo tres de los péptidos fueron confirmados (G1, G4 y G6), por lo que se los sintetizó en mayor cantidad para ser inmovilizados en la resina Iodoacetil-SulfoLink. Se ensayaron cromatografías con la hormona pura en distintas condiciones de adsorción y eluyendo con buffer acetato de sodio/ácido acético 100 mM pH 3.6, NaCl 250 mM. Se observó que la mejor condición encontrada se obtuvo con G4 en buffer Tris/HCl 50 mM pH 9 y permitió un 87% de adsorción.Nuestra metodología permitió encontrar un péptido con afinidad por la hormona de crecimiento recombinante. Se seguirá trabajando con el mismo péptido para seguir caracterizándolo (isotermas de adsorción, curvas de breakthrough) y se ensayarán cromatografías con la rhGH en leche para determinar la selectividad del mismo frente a una mezcla compleja.Referencias1.Jian Kang, Fei Wu, Yunpeng Cai, Mingxin Xu, Mu He, Weien Yuan. Development of Recombinant Human Growth Hormone (rhGH) sustained-release microspheres by a low temperature aqueous phase/aqueous phase emulsion method. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 2014;62:141-147.2.Zdenko Levarski, Andrea ?oltýsová, Ján Krahulec, Stanislav Stuchlík, Ján Turňa. High-level expression and purification of recombinant human growth hormone produced in soluble form in Escherichia coli, Protein Expression and Purification. 2014;100:40-47.3.Rezaei M, Zarkesh-Esfahani SH. Optimization of production of recombinant human growth hormone in Escherichia coli. Journal of Research in Medical Sciences: The Official Journal of Isfahan University of Medical Sciences. 2012;17(7):681-685.4.Ashok K Patra, R Mukhopadhyay, R Mukhija, Anuja Krishnan, L.C Garg, Amulya K Panda. Optimization of Inclusion Body Solubilization and Renaturation of Recombinant Human Growth Hormone from Escherichia coli. Protein Expression and Purification. 2000;18(2):182-192.5.Daniel Salamone, Lino Barañao, Claudio Santos, Leonardo Bussmann, Jorge Artuso, Carlos Werning, Aida Prync, Cesar Carbonetto, Susana Dabsys, Carlos Munar, Roberto Salaberry, Guillermo Berra, Ignacio Berra, Nahuel Fernández, Mariana Papouchado, Marcelo Foti, Norberto Judewicz, Ignacio Mujica, Luciana Muñoz, Silvina Fenández Alvarez, Eliseo González, Juan Zimmermann, Marcelo Criscuolo, Carlos Melo. High level expression of bioactive recombinant human growth hormone in the milk of a cloned transgenic cow. Journal of Biotechnology. 2006;124(2):469-472.6.D.P. Harris, A.T. Andrews, G. Wright, D.L. Pyle, J.A. Asenjo. The application of aqueous two-phase systems to the purification of pharmaceutical proteins from transgenic sheep milk. Bioseparation. 1998;7(1):31-37.7.María C. Martínez-Ceron, Mariela M. Marani, Marta Taulés, Marina Etcheverrigaray, Fernando Albericio, Osvaldo Cascone, and Silvia A. Camperi. Affinity Chromatography Based on a Combinatorial Strategy for rErythropoietin Purification. ACS Comb. Sci. 2011;13(3):251?258.