INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
DOBLE SCREENING AUTOMÁTICO Y MALDI TOF MSMS PARA LA BÚSQUEDA DE NUEVOS LIGANDOS PEPTÍDICOS
Autor/es:
M. C. MARTÍNEZ CERON; S. L. GIUDICESSI; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
Los Cocos, Córdoba
Reunión:
Congreso; II Congreso Argentino de Espectrometría de Masa; 2014
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Espectrometría de Masa
Resumen:
Los péptidos cortos son excelentes ligandos para cromatografía de afinidad. El método dividir-acoplar-recombinar permite obtener bibliotecas peptídicas con todas las combinaciones de los aminoácidos en la que cada bolilla de resina contiene una única entidad peptídica. Utilizando este tipo de bibliotecas se ha podido obtener ligandos con actividad farmacéutica, usos analíticos o de afinidad para la purificación de proteínas. Para hallar ligandos, la biblioteca se somete a un screening. Este consiste en poner a interaccionar una pequeña cantidad de la proteína blanco con la biblioteca e identificar las bolillas que adsorbieron la proteína y que por lo tanto contienen a los péptidos que presentan afinidad. La identificación de las bolillas que contienen estos péptidos con afinidad puede hacerse marcando la proteína con una enzima, un colorante fluorescente u otro tipo de etiqueta. Las bolillas que interactúan con la proteína marcada, son aisladas para determinar la secuencia del péptido. Existe la posibilidad, cuando se realiza el screening, de encontrar falsos positivos. Con el fin de evitar la selección de estas bolillas, se diseñó un nuevo método de doble screening completamente automático utilizando colorantes fluorescentes y el Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS), un equipo que aisla bolillas fluorescente. Los colorantes fluorescentes utilizados fueron la Rodamina (R) no activa y su forma activa, Texas red (Tr), capaz de conjugarse con una proteína, el.La proteína modelo que se marcó con Tr fue el toxoide del tétanos. En el primer paso de screening, se puso en contacto la biblioteca con R. Aquellas bolillas que presentaron fluorescencia fueron aisladas en forma automática utilizando el COPAS y luego se las descartó por presentar afinidad por la etiqueta.En el segundo paso de screening, todas las bolillas que no presentaron fluorescencia en el paso anterior fueron recuperadas, acondicionadas y puestas en contacto con el toxoide del tétanos marcado con Tr. Las bolillas fluorescentes se aislaron en forma automática utilizandoel COPAS. Finalmente se lavaron las bolillas aisladas y se secuenciaron los péptidos que contenían con un espectrómetro de masas MALDI TOF MSMS Proteomics Analyzer Instrument (Applied Biosystems). Las muestras fueron sembradas en la placa-electrodo del equipo utilizando el método de ?Depósito de Capas Secas Sucesivas? o ?Successive Dry Layers Deposit?. Una vez secuenciados, los péptidos fueron analizados para determinar la frecuencia de aparición de aminoácidos por posición y la presencia de patrones característicos. De esta manera se seleccionaron dos péptidos que serán sintetizados en mayor cantidad para ser acoplados a un soporte adecuada y se determinará su eficiencia como matriz cromatográfica de afinidad para la purificación del toxoide del tétanos a partir de sobrenadante de cultivos de Clostridium tetanis.
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