INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
ESTRATEGIA QUÍMICA COMBINATORIA PARA EL DISEÑO DE LIGANDOS PEPTÍDICOS Y PEPTIDOMIMÉTICOS PARA CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
Autor/es:
M. C. MARTÍNEZ-CERON; S. L. GIUDICESSI; M.M. MARANI; J.N.KRUSZYN; F.ALBERICIO; O.CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
La Plata
Reunión:
Simposio; II Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos SAPROBIO 2012; 2012
Institución organizadora:
Universidad de La Plata
Resumen:
Introducción: La cromatografía de afinidad (AC) se basa en el principio de reconocimiento molecular entre un ligando inmovilizado en una matriz cromatográfica y la molécula a purificar. Debido a su alta selectividad es la técnica ideal para la purificación de proteínas recombinantes a partir de caldos de cultivo. Para obtener una purificación exitosa por AC es necesario contar con ligandos adecuados en cuanto a selectividad y afinidad. Los péptidos cortos son ideales como ligandos para separaciones industriales por ser económicos, de alta estabilidad y fácil manufactura. El objetivo del trabajo fue desarrollar una estrategia para el diseño de ligandos de afinidad basada en: a) la síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas, b) el screening de las bibliotecas, c) la identificación de los péptidos por espectrometría de masas, d) el análisis de la afinidad de los péptidos e) la síntesis de análogos más estables frente a posibles proteasas presentes en los caldos de cultivo. Metodología: Sobre la resina ChemMatrix se inmovilizó el ancla ácido hidroximetilbenzoico (HMBA) y se sintetizaron bibliotecas combinatorias peptídicas utilizando el método de dividir-acoplar-recombinar que se basa en (i) dividir el soporte sólido en tantas porciones como aminoácidos a utilizar en la construcción de la biblioteca, (ii) acoplar en cada porción un aminoácido diferente y (iii) mezclar las porciones y repetir los pasos n veces (n = longitud de los péptidos de la biblioteca). De esta manera se asegura que cada bolilla de resina presente una sola entidad peptídica. Para realizar el screening de las bibliotecas se marcaron las proteínas de interés con biotina o con el colorante fluorescente Texas Red y se pusieron en contacto las bibliotecas con las proteínas marcadas. Se aislaron las bolillas fluorescentes y aquellas que se colorearon luego de ser reveladas con estreptavidina-peroxidasa y 3-3´ diaminobencidina. Se lavaron las bolillas y los péptidos unidos a las mismas se clivaron con vapor de amoníaco. El péptido contenido en cada bolilla de resina se eluyó en 120 µl de una mezcla ácido acético/metanol/agua y se sembró 1 µl en la placa de MALDI con matriz ácido α-ciano-4-hidroxicinámico para su identificación por espectrometría de masas MALDI-TOF MS/MS. Se resintetizaron los péptidos en fase sólida y se estudió la afinidad entre las proteínas de interés y los péptidos con un biosensor de resonancia plasmática de superficie Biacore T100. Para sintetizar péptidos análogos con mayor estabilidad frente a proteasas se ensayaron diferentes estrategias de síntesis para la obtención de péptidos ciclados y peptidomiméticos remplazando la unión amida por unión amina. Los ligandos peptídicos y peptidomiméticos desarrollados se inmovilizaron en matrices de agarosa y se purificaron las proteínas de interés por AC. Resultados: La propiedad anfifílica de la resina ChemMatrix permitió tanto la síntesis de la biblioteca combinatoria peptídica con solventes orgánicos como el screening en medio acuoso. El doble screening con conjugados proteína-biotina y proteína-Texas Red evitó la selección de falsos positivos. El ancla HMBA permitió el clivaje de los péptidos con vapor de amoníaco para su posterior secuenciación por MALDI-TOF MS/MS. Del análisis de afinidad entre los péptidos candidatos y las proteínas de interés con el Biacore T100 se seleccionaron los ligandos más apropiados. Se sintetizaron análogos ciclados a través de la formación de una unión amida entre el amino terminal del péptido y un ácido aspártico incorporado en la secuencia peptídica, utilizando grupos protectores de cadenas laterales adecuados para evitar reacciones secundarias. Para reemplazar uniones amidas por uniones amina se incorporó en la secuencia peptídica en lugar del aminoácido el aminoaldehído correspondiente a través de amidación reductiva. Los ligandos peptídicos y peptidomiméticos inmovilizados en matrices cromatográficas permitieron la purificación de las proteínas de interés en forma selectiva. Conclusiones: La estrategia permite la identificación de péptidos con afinidad por proteínas en un corto tiempo, a un bajo costo y con una alta sensibilidad, permitiendo la generación de múltiples réplicas a partir de una bolilla lo que maximiza las chances de una identificación correcta del ligando inmovilizado en una bolilla de resina. Esto acelerará la identificación de ligandos peptídicos sintéticos de afinidad para la purificación de nuevos biofármacos introducidos por la industria farmacéutica.
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