INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
SECUENCIACIÓN DE PÉPTIDOS POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS. SU APLICACIÓN EN EL DISEÑO DE LIGANDOS PARA BIOFÁRMACOS
Autor/es:
S. A. CAMPERI
Lugar:
Los Cocos, Córdoba
Reunión:
Congreso; I Congreso Argentino de Espectrometría de masa; 2012
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Espectrometría de masa
Resumen:
En las últimas décadas la espectrometría de masas (MS) basada en técnicas de ionización blandas: desorción/ionización láser asistida por matriz (MALDI) 1,2 e ionización por electrospray (ESI) 3 ha ido desplazando a la secuenciación de Edman en la identificación de péptidos y proteínas. La alta sensibilidad y rapidez de MS permite la secuenciación de unos pocos picomoles de péptido en cuestión de segundos a diferencia de la secuenciación de Edman en la que se necesitan horas o días. Además, se pueden analizar péptidos modificados y no es necesaria su purificación a homogeneidad. La fragmentación de los péptidos genera series de señales que permiten su identificación. Cada fragmento de una serie difiere de su vecino por un aminoácido, siendo posible determinar la secuencia teniendo en cuenta la diferencia de masas entre picos vecinos de una misma serie. En esta presentación se describe la aplicación de la espectrometría de masas en el diseño péptidos con afinidad por proteínas recombinantes terapéuticas. Los biofármacos o proteínas recombinantes terapéuticas son una nueva generación de medicamentos producidos en biorreactores a partir de bacterias o células eucariotas recombinantes. Debido a que su administración es parenteral, deben ser purificados a partir del caldo de cultivo celular con un grado de pureza superior al 99%. Cuando se trata de purificar proteínas recombinantes de interés terapéutico, presentes en muy baja concentración en mezclas complejas, la mejor opción es la cromatografía de afinidad. Esta técnica permite alcanzar un alto grado de purificación y excelentes rendimientos en un único paso. El desafío es encontrar un ligando con suficiente selectividad por el biofármaco, y a la vez económicamente viable a escala industrial. Los péptidos cortos, debido a su fácil síntesis, alta estabilidad química y bajo costo con respecto a los ligandos proteicos, son una alternativa ideal. El método dividir-acoplar-recombinar (DAR) descripto por Lam y col. 4 permite la síntesis de bibliotecas combinatorias en fase sólida en las cuales cada bolilla de resina presenta una única entidad peptídica. Consiste en: a) dividir el soporte sólido en partes iguales, b) acoplar en cada porción un aminoácido diferente, c) mezclar las porciones y luego volver a dividirlas para realizar el siguiente acople. Para hallar los péptidos con afinidad por la proteína de interés se realiza un screening en fase sólida marcando la proteína con un colorante fluorescente o una enzima que desarrolle una reacción de color. Finalmente, se aíslan las bolillas coloreadas o fluorescentes para secuenciar el péptido de cada bolilla seleccionada. Si bien, tanto ESI MS como MALDI MS son las técnicas de elección para la secuenciación de péptidos, MALDI MS es mucho más rápida para el análisis de múltiples muestras y por lo tanto ideal para la secuenciación de péptidos en las bolillas seleccionadas. Por otra parte, una vez que la muestra es analizada por ESI MS, no se puede volver a analizar. Una restricción que MALDI no comparte ya que las muestras son depositadas sobre la placa del equipo y pueden ser analizadas más de una vez. Además, estando las muestras depositadas en la placa, uno puede analizarlas en el tiempo deseado. Con ESI el tiempo del análisis está limitado al ancho del pico cromatográfico. En esta presentación se describen estrategias para hallar ligandos para cromatografía de afinidad basadas en la síntesis y el screening de bibliotecas combinatorias peptídicas y la identificación de los péptidos afines a la proteína de interés por MALDI TOF/TOF MS/MS. Las mismas permiten acelerar el diseño ligandos selectivos para la purificación de la gran cantidad de proteínas recombinantes terapéuticas en desarrollo en la industria farmacéutica. Referencias: 1-Karas M.; Hillenkamp F.; Anal. Chem.,1988, 60, 2299-3201. 2-Tanaka, K.; Waki, H.; Ido, Y.; Akita, S.; Yoshida, Y.; Yoshida, T.; Matsuo, T.; Rapid Commun. Mass Spectrom., 1988, 2, 151-15. 3-Fenn, J. B.; Mann, M.; Meng, C. K.; Wong, S. F. ; Whitehouse, C. M.; Science, 1989, 246, 64-71 4-Lam. K.S.; Salmon, S.E.; Hersh, E.M.; Hruby, V.J.; Kazmierski, W.M.; Knapp, R.J.; Nature, 1991, 354, 82-84.
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