INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
ESTRATEGIA DE SÍNTESIS DE BIBLIOTECAS DE PÉPTIDOS CÍCLICOS CODIFICADAS PARA SU FÁCIL IDENTIFICACIÓN POR MALDI-TOF MS/MS
Autor/es:
S. L. GIUDICESSI; J. M. GUREVICH-MESSINA; M. C. MARTÍNEZ CERON; R. ERRA-BALSELLS; F. ALBERICIO; O. CASCONE; S. A. CAMPERI
Lugar:
Los Cocos, Córdoba
Reunión:
Congreso; I Congreso Argentino de Espectrometría de masa; 2012
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Espectrometría de masa
Resumen:
Los ligandos peptídicos cortos tienen gran aplicación en el desarrollo de matrices de afinidad para la purificación de proteínas a partir de mezclas complejas debido a su fácil síntesis bajo normas GMP, alta estabilidad química en comparación con ligandos proteicos y adecuada afinidad. La síntesis de bibliotecas combinatorias peptídicas permite el screening simultáneo de miles de péptidos para encontrar ligandos de afinidad para cualquier proteína de interés. El método dividir-acoplar-recombinar (DAR) permite la síntesis de bibliotecas combinatorias en fase sólida en las cuales cada bolilla de resina presenta una única entidad peptídica. Consiste en: a) dividir el soporte sólido en partes iguales, b) acoplar en cada porción un aminoácido diferente, c) mezclar las porciones y luego volver a dividirlas para realizar el siguiente acople.1 Para hallar los péptidos con afinidad por la proteína de interés se realiza un screening en fase sólida marcando la proteína con un colorante fluorescente o una enzima que desarrolle una reacción de color. Finalmente, se aíslan las bolillas coloreadas o fluorescentes para secuenciar el péptido de cada bolilla seleccionada. La mayor rigidez de los péptidos cíclicos con respecto a los lineales permite el desarrollo de ligandos de mayor afinidad y especificidad por la proteína de interés y mayor estabilidad frente a proteasas comúnmente presentes en las muestras crudas donde se halla la proteína a purificar. Sin embargo, debido a las dificultades para secuenciar péptidos cíclicos, las bibliotecas de péptidos cíclicos requieren de la síntesis simultánea de un código para su identificación. El objetivo del presente trabajo fue el desarrollo de una estrategia de síntesis de bibliotecas de péptidos cíclicos codificadas para la identificación del péptido cíclico presente en cada bolilla de resina seleccionada por MALDI-TOF MS/MS. La estrategia consistió en: a) inmovilizar sobre las bolillas de resina ChemMatrix el ancla ácido 4-hidroxilmetilbenzoico (HMBA), b) acoplar sobre la resina un 10-20% de Fmoc-Ala-OH y 80-90% de Fmoc-Glu(2-fenilisopropil éster)-OH, c) sobre la resina modificada sintetizar la biblioteca combinatoria por el método DAR, d) una vez agregados todos los aminoácidos eliminar el grupo Fmoc del amino terminal con piperidina/dimetilformamida, e) clivar específicamente el grupo protector del Glu, 2-fenilisopropil éster (2-PhiPr) con solución de ácido trifluoroacético (TFA) 4% en diclorometano , f) ciclar los péptidos en fase sólida a través de la formación de una unión amida entre el carboxilo del Glu y el amino terminal del péptido con benzotriazol-1-il-oxi-tris-pirrolidinofosfonio hexafluorofosfato, 1-hidroxi-7-azabenzotriazol y diisopropiletilamina, g) clivar los demás grupos protectores de cadenas laterales con TFA-triisopropil silano (TIS)-H2O (95:2.5:2.5). Con la estrategia desarrollada se obtiene una biblioteca donde cada bolilla de resina tiene un 80-90% de péptido cíclico y un 20-10% del péptido lineal con la misma secuencia que el cíclico. Ésta último sirve de código para secuenciar el péptido por MALDI-TOF MS/MS. Para clivar los péptidos de las bolillas para su secuenciación por MALDI-TOF MS/MS, cada bolilla aislada fue colocada en un microtubo eppendorf, los cuales se dispusieron dentro de un desecador junto a un frasco conteniendo NH4OH. Se cerró el desecador y se dejó toda la noche a temperatura ambiente. Esto permitió el clivaje del péptido unido al ancla HMBA por una unión éster. Luego, se eluyeron los péptidos de cada bolilla con AcOH/MeCN/H2O (3:4:3). Los espectros de masas se realizaron en un equipo 4700 Proteomics Analyzer Instrument (Applied Biosystems) y en un Ultraflex II TOF/TOF (Bruker). Se sembró la muestra por el método de depósito de capas secas sucesivas (Successive Dry Layers Deposit, SDLD). Para ello se sembró 1µl del eluato proveniente de una sola bolilla sobre la placa de muestra del equipp MALDI-TOF, se dejó secar a temperatura ambiente y luego se añadió 1 µl de matriz CHCA (4 mg/ml) en una solución de MeCN/H2O (1:1) con TFA 0,1% y se dejó secar nuevamente. Los espectros de masas se realizaron en modo reflectron ion positivo y los espectros MS/MS se obtuvieron en modo positivo.2 La mayor proporción de péptido cíclico con respecto al lineal favorece la selección de bolillas que contienen los péptido cíclicos con afinidad por la proteína de interés. Debido a la alta sensibilidad de MALDI-TOF MS/MS y a la alta capacidad de inmovilización de péptidos de la resina ChemMatrix, con sólo un 10%-20% de péptido lineal en cada bolilla de resina, es posible determinar su secuencia. El grupo protector 2-PhiPr se cliva específicamente con TFA 4%. La mayoría de los grupos protectores de cadenas laterales son estables bajo dichas condiciones. Sin embargo, hay que evitar el uso de Fmoc-His(Trt)-OH y en su reemplazo utilizar Fmoc-His(Boc)-OH. Una vez ciclado el péptido se realiza el clivaje de los demás grupos protectores con TFA 95%. La unión entre el péptido y el ancla HMBA es estable a todas las condiciones de síntesis y clivaje de grupos protectores de cadenas laterales. Esto permite realizar el screening de la biblioteca en fase sólida. Para liberar el péptido de cada bolilla de resina seleccionada para su posterior secuenciación por MALDI-TOF MS/MS se utiliza vapor de amoníaco. La resina ChemMatrix, resina a base de polietilenglicol, formada exclusivamente por uniones éter, es estable bajo dichas condiciones. A su vez, su compatibilidad con medios orgánicos y acuosos permite la síntesis de los péptidos en medio orgánico y el screening de la biblioteca en medio acuoso. Referencias: 1-Lam. K.S.; Salmon, S.E.; Hersh, E.M.; Hruby, V.J.; Kazmierski, W.M.; Knapp, R.J.; Nature, 1991, 7, 354, 82-84. 2-Martínez-Ceron, M.C.; Giudicessi, S.L.; Marani, M.M.; Albericio, F.; Cascone, O.; Erra-Balsells, R.; Camperi, S. A.; Anal. Biochem., 2010, 15, 400, 295-297.
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