INVESTIGADORES
CAMPERI Silvia Andrea
congresos y reuniones científicas
Título:
Péptidos cortos para la purificación de toxoide tetánico con el objeto de producir vacunas de alta pureza
Autor/es:
M. C. MARTÍNEZ-CERON; L ÁVILA; S. L. GIUDICESSI; M. FINGERMANN; F. ALBERICIO; S. A. CAMPERI; O. CASCONE
Reunión:
Congreso; ETIF 2016; 2016
Institución organizadora:
Comité Científico de ETIF 2016
Resumen:
El tétanos es una infección grave causada por Clostridium tetani que produce una potente neurotoxina: la toxina tetánica (Tt). Esta inhibe la liberación en el espacio intersináptico de neurotransmisores como el ácido gamma-aminobutírico y la glicina, lo que genera un fallo de los reflejos motores por estimulación sensorial y aparición de contracciones generalizadas de músculos, que generan espasmos. Esta enfermedad es tratada aplicando suero equino hiperinmune antitétanos [1] pero su prevención se logra con un programa adecuado de vacunación. El toxoide del Tétanos (Ttx) utilizado para la preparación de vacunas se obtiene por inactivación con formaldehido de la Tt producida por C. tetani [2]. Generalmente para la preparación de vacunas se emplea el Ttx parcialmente purificado por ultrafiltración [3]. Las reacciones colaterales producidas por la vacunación están directamente relacionadas con la presencia de contaminantes en las vacunas. Dichos contaminantes provienen de la reacción del formaldehido con componentes del medio de cultivo y con productos del metabolismo de. C. tetani presentes en los sobrenadantes de cultivo. El aumento del grado de pureza del Ttx disminuiría las reacciones adversas producidas por la vacunación y permitiría el aumento de la dosis, mejorando el sistema de inmunización [4].Actualmente existen protocolos de purificación para obtener Tt y Ttx con alto grado de pureza pero debido a su costo elevado sólo se aplican a nivel analítico y no en la preparación industrial de vacunas. En general consisten en la recuperación de la toxina Tt por precipitación a partir de sobrenadantes de cultivos seguidos de una serie consecutiva de pasos cromatográficos que incluyen: cromatografía de exclusión molecular [5] y de afinidad con anticuerpos poli y monoclonales [6].Los procesos de afinidad se basan en un reconocimiento molecular entre la proteína de interés y un ligando inmovilizado sobre un soporte. Con un ligando de afinidad con la selectividad adecuada, se puede purificar la proteína de interés presente en mezclas complejas, logrando alta pureza y rendimiento en un solo paso [7]. Los péptidos cortos son adecuados como ligandos de afinidad ya que son estables y resistentes a la acción de proteasas. Se pueden producir a granel, a bajo costo y alta pureza bajo normas GMP en forma sintética. A su vez, las interacciones entre los péptidos y las proteínas son generalmente moderadas, lo que resulta en condiciones suaves de elución [8].Para desarrollar un proceso de afinidad altamente selectivo para Ttx es esencial la identificación de un péptido con suficiente selectividad y fuerza de unión. El método dividir-acoplar-recombinar permite obtener bibliotecas combinatorias de péptidos sobre bolillas de de un polímero soporte en la que cada bolilla contiene una única entidad peptídica. Utilizando este tipo de bibliotecas se ha podido obtener ligandos con actividad farmacéutica, usos analíticos o de afinidad para la purificación de proteínas. Para hallar ligandos, la biblioteca se somete a un screening. Éste consiste en poner a interaccionar una pequeña cantidad de la proteína blanco con la biblioteca e identificar las bolillas que adsorben la proteína y que por lo tanto contienen a los péptidos que presentan afinidad. La identificación de las bolillas que contienen estos péptidos con afinidad puede realizarse marcando la proteína con una enzima, un colorante fluorescente u otro tipo de etiqueta. Las bolillas que interactúan con la proteína marcada, son aisladas para determinar la secuencia del péptido. Existe la posibilidad, cuando se realiza el screening, de encontrar falsos positivos. Con el fin de evitar la selección de estas bolillas, se diseñó un nuevo método de doble screening completamente automático utilizando colorantes fluorescentes y el Complex Object Parametric Analyzer and Sorter (COPAS), un equipo que aísla bolillas fluorescentes.Los colorantes fluorescentes utilizados fueron la Rodamina (R) no activa y su forma activa, Texas Red (Tr), capaz de conjugarse con una proteína. En este caso se marcó con Tr el toxoide tetánico. En el primer paso de screening, se puso en contacto la biblioteca con R. Aquellas bolillas que presentaron fluorescencia fueron aisladas en forma automática utilizando el equipo COPAS y luego se las descartó por presentar afinidad por la etiqueta. En el segundo paso de screening, todas las bolillas que no presentaron fluorescencia en el paso anterior fueron recuperadas, acondicionadas y puestas en contacto con el toxoide tetánico marcado con Tr. Las bolillas fluorescentes se aislaron en forma automática utilizando el equipo COPAS. Finalmente, se secuenciaron los péptidos que contenían las bolillas aisladas, utilizando un espectrómetro de masas MALDI TOF MSMS Proteomics Analyzer Instrument (Applied Biosystems). Una vez secuenciados, los péptidos fueron analizados para determinar la frecuencia de aparición de aminoácidos por posición y la presencia de patrones característicos.De esta manera se seleccionó un péptido (LRVYHGGAGK) para ser inmovilizado en NHS-Sepharose con el objeto de ensayar diferentes condiciones cromatográficas para la purificación del Ttx. Se seleccionaron para la adsorción el buffer de fosfatos 20 mM-Tween 20 0,05%, pH 5,9 y el buffer de elución Tris-HCl 100 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM y se sembró una muestra de proteína pura aportada por el Instituto Nacional de Producción de Biológicos, ANLIS-Malbrán. En estas condiciones el 96% de la muestra fue adsorbida.Próximamente, se determinará la constante de afinidad y se ensayará con muestras de sobrenadante de cultivo tratado con formaldehido para determinar si la columna cromatográfica permite recuperar el Ttx del resto de las proteínas contaminantes con alto rendimiento y pureza.Referencias:1 Hassel, B., Tetanus: pathophysiology, treatment, and the possibility of using botulinum toxin against tetanus-induced rigidity and spasms. Toxins (Basel), 2013. 5(1): p. 73-83.
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