Espectroscopía Raman como herramienta para monitoreo en bioprocesos de producción de Biopolímeros tipo β-glucano y su posterior caracterización

FARIÑA JI; VALDEZ AL; ALVAREZ RMS; LADETTO MF; JOCHEN SCHMID

Tucumán

Simposio; V Simposio Argentino de Bioprocesos SAPROBIO 2018; 2018

PROIMI-CONICET-UNT-EEAOC

ResumenEl objetivo de este trabajo es proponer a la espectroscopía Raman como herramientapara el monitoreo de la producción y posterior caracterización de β-glucanos.Con este propósito, se evaluó la producción de escleroglucano (β-1,3-β-1,6-glucanoproducido por hongos del género Sclerotium)en biorreactor (3 L) durante 72 h de cultivo bajo condiciones operativasestandarizadas. Para  el monitoreo de laproducción de exopolisacárido (EPS), se registraron espectros Raman de muestrascolectadas a diferentes tiempos de cultivo. La detección de bandascaracterísticas reveló la presencia del polímero de interés en el caldo decultivo, y los incrementos observados en sus intensidades se relacionaron con  la abundancia del mismo. Por otro lado, seevaluaron los EPS obtenidos mediante dos métodos de procesamientopost-fermentación (downstream processing, DSP) para su recuperación y purificación, y se compararon con una muestra deescleroglucano comercial.PalabrasclaveEspectroscopía;Raman; β-glucano; Escleroglucano 1.      IntroducciónLosexopolisacáridos (EPSs), biopolímeros de origen microbiano, han cautivado enlos últimos años a la industria mundial gracias a su naturaleza eco-amigable,sus interesantes propiedades fisicoquímicas y la notable versatilidad en lo querespecta a sus aplicaciones. Sin embargo, algunas de estas propiedadesdeseables podrían verse comprometidas durante la biosíntesis y/o el proceso derecuperación o purificación, lo que convierte al seguimiento de estas etapas enuna faceta clave. El monitoreo de la producción en biorreactores constituye unaspecto esencial, sobre todo cuando se trabaja a grandes escalas, y puede resultarun proceso técnicamente engorroso y costoso en tiempo y recursos, por lo que suoptimización es crucial para la industria. Por lo tanto, existe una intensa ypermanente búsqueda de herramientas que permitan simplificar, acelerar o abaratarestas etapas.Laespectroscopía Raman es una técnica fisicoquímica no destructiva,complementaria a la espectroscopía infrarroja, que se basa en el estudio de lasvibraciones moleculares para obtener información valiosa sobre la estructura delos sistemas. Esta técnica es lo suficientemente sensible para distinguir entrediferentes confórmeros, o caracterizar la estructura secundaria de macromoléculas(es decir, moléculas con la misma estructura covalente y diferente plegamientou orientación espacial). Entre sus principales ventajas, permite realizaranálisis de muestras biológicas y soluciones acuosas sin interferencia del agua,brindando espectros  de forma rápida ycon mínima preparación de la muestra. En general las bandas Raman son biendefinidas y los sobretonos y bandas de combinación son escasos. Todo elloconvierte a la espectroscopía Raman en una buena aliada a la hora de analizar unasustancia, incluso si ésta se encuentra en matrices complejas, como es el casode los caldos de cultivo en biorreactores. También, gracias a su capacidad paraestudiar isomerías y polimorfismos, resulta una herramienta analítica particularmenteútil e innovadora en la identificación, evaluación y caracterización delproducto final.2.       MetodologíaEnprimer lugar, se registraron los espectros Raman de las siguientes sustancias comercialespuras: escleroglucano (LSCL, Mw 4.5×105 Da, CarboMer, USA), glucosa, fructosa yácido oxálico. Todas las medidas se realizaron tanto en estado sólido como ensolución con agua destilada. A continuación, se registró el espectro del mediode cultivo puro sin inocular.Parael seguimiento de la producción, se produjo EPS a escala biorreactor con mediode cultivo optimizado (MOPT) y bajo condiciones operativas estandarizadas [1]. Secolectaron muestras a diferentes tiempos de cultivo (c/12 h) y se registraronlos espectros Raman de cada una; de los sobrenadantes de centrifugación y de labiomasa obtenida. Se ensayaron dos métodos de procesamiento post-fermentación(DSP):-Un protocolo consistente en la dilución del caldo con agua destilada,neutralización, calentamiento y centrifugación; seguido de la precipitación enfrío del EPS por adición de etanol 96° (1:1 v/v) al sobrenadante y posterior enfriamientoovernight [1].-El segundo protocolo DSP fue idéntico al anterior hasta la etapa decentrifugación, luego el sobrenadante fue agregado gradualmente con agitaciónmecánica a un volumen equivalente de etanol 96° frío (efecto Weissenberg) [2].LosEPS así obtenidos y purificados fueron estudiados por microscopía Ramanconfocal.3.      Resultadosy discusiónSecompararon los espectros correspondientes a los diferentes tiempos deproducción, tomando como referencia los del medio de cultivo sin inocular y elespectro del polímero puro en solución con agua destilada. A medida que progresóel cultivo, se observó una disminución en la intensidad de bandascorrespondientes al medio de cultivo, concordantemente con el consumo dealgunos nutrientes. Asimismo, se observó un incremento en la intensidad debandas que corresponderían a metabolitos producidos por el hongo, entre ellos yparticularmente, el EPS.Encuanto a los EPS obtenidos, al evaluar la influencia del método DSP, se observaronvariaciones en las intensidades relativas de las bandas de deformación C-OHsituadas a 1112 y 1095 cm-1, que se verían afectadas por laestructura terciaria del polímero, dado que éstos -OH estarían involucrados enlos puentes hidrógeno que dan lugar a la estructura de triple hélice. Esto conllevaa pensar que el método de procesamiento influiría en la rigidez o grado decompactación de la triple hélice formada. En todos los casos se observó unamarcada similitud entre los espectros de los escleroglucanos obtenidos y elcomercial (LSCL).4.      Conclusiones-La notable concordancia entre el espectro del escleroglucano obtenido enbiorreactores y el comercial permitió demostrar la buena calidad del polímeroproducido a escala banco en nuestro laboratorio, y sentaría las bases para supotencial escalamiento y ulterior comercialización.-A pesar de que las muestras en estudio poseen igual estructura 1ª y 2ª, laespectroscopía Raman demostró ser una herramienta útil para evidenciardiferencias a nivel de estructura 3ª.-El estudio sugiere además que la espectroscopía Raman es una herramienta losuficientemente sensible para detectar al polímero en matrices complejas ypermitir el monitoreo de la producción, pudiendo ser extensible al estudio deotros procesos en biorreactores.5.      Bibliografía[1]J.I. Fariña, F. Siñeriz, O.E. Molina & N.I. Perotti (1998). Biotechnol. Lett., 20:825?831.[2]M.F. Ladetto, A.L. Valdez, O.D. Delgado, J. Schmid, R.M.S. Álvarez & J.I.Fariña, XII SAP2017, 2017.6.      AgradecimientosSCAIT- CIUNT (Consejo de Investigaciones de la UNT) - PIP (CONICET) 0976, PCBII CONICET-MINCyT-DFG