ACTIVIDAD DE LIPOXIGENASA DE SOJA EN MICELAS DIRECTAS E INVERSAS

ANALÍA V. MEDINA; CECILIA L. SALCEDO; LUCRECIA L. CHAILLOU; MÓNICA A. NAZARENO

Remedios de Escalada, Lanús Oeste. Buenos Aires

Congreso; XXVIII Congreso Argentino de Química; 2010

Asociación Argentina de Química

INTRODUCCIÓN La lipoxigenasa (LOX) es una enzima que cataliza reacciones de oxidación de ácidos grasos insaturados que presentan en su estructura un sistema cis,cis-1,4-pentadieno originando hidroperóxidos conjugados como productos primarios de oxidación [1]. Esta enzima prooxidante está ampliamente distribuida en vegetales, animales, hongos y algunas bacterias. En el reino vegetal, la LOX interviene en la germinación de semillas, maduración de frutos, mecanismos de defensa frente a factores de estrés, etc. En mamíferos, los productos resultantes de su actividad catalítica son intermediarios en la formación de biorreguladores involucrados en procesos como inflamación, artritis, etc. Debido a que en la matriz alimentaria estas enzimas y los sustratos se encuentran distribuidos en diferentes microfases de acuerdo a su hidro y lipofilicidad, para simular estas condiciones, el estudio de su actividad se llevó a cabo en sistemas micelares directos e inversos, para lo que se emplearon diferentes sustancias anfifílicas como los surfactantes en medios acuosos y orgánicos como sistemas modelo.   Existen antecedentes acerca de la medición de la actividad de LOX en micelas directas y micelas inversas de AOT [2-3]; sin embargo no se han encontrado determinaciones de la actividad enzimática en sistemas constituidos por mezcla de surfactantes. En este estudio se propone determinar la actividad enzimática de LOX extraída de soja en micelas directas utilizando Tween-20 como surfactante no iónico en agua, mientras que para la formación de micelas inversas se utilizó un surfactante aniónico denominado AOT, y mezclas de AOT/Tween-20, en isooctano. El objetivo de este trabajo fue comparar la actividad enzimática de los diferentes sistemas y determinar cuáles son sus condiciones óptimas, teniendo en cuenta que las enzimas son altamente dependientes de factores como pH, concentración de sustrato y contenido de agua para micelas inversas. METODOLOGIA Aislamiento de LOX de soja: Una mezcla de 5 g de soja pelada y triturada con 50 ml de agua ultrapura se agitó durante 20 min. Posteriormente se adicionaron 0.05 g de PVPP y CaCl2 hasta 43 mM para precipitar compuestos fenólicos y proteínas de almacenamiento, respectivamente. La mezcla fue homogeneizada durante 15 min e incubada a 8°C durante 30 min. Luego centrifugó a 12.000g por 10 min, utilizándose el sobrenadante para las determinaciones de actividad [4]. Actividad enzimática: Las determinaciones se realizaron mediante análisis espectrofotométricos a 234 nm basados en la formación de hidroperóxidos conjugados como consecuencia de la oxidación de ácido linoleico usado como sustrato. Se utilizaron celdas de cuarzo de paso óptico reducido de 0.2 cm, y la actividad fue calculada por corrección de absorbancia a 1 cm de paso óptico. Una unidad de actividad de LOX se define como la cantidad que causa un incremento en absorbancia a 234 nm de 0.001 UA/min a 25°C cuando AL es el sustrato en un volumen de 3.0 ml para1 cm de paso óptico. Actividad enzimática de LOX en micelas directas: Se emplearon soluciones buffer con pH entre 6 y 11, y el monitoreo de absorbancia a 234 nm se realizó en 10 ciclos cada 20 seg. Actividad enzimática de LOX en micelas inversas: La actividad de ambos  sistemas formados por AOT/isooctano/agua y AOT/Tween-20/isooctano/agua se determinó a diferentes concentraciones de AL, contenidos de agua y valores de pH. La cantidad de agua del sistema fue expresada como la relación molar de agua y surfactante (W= [H2O]/[Surfactante]). La concentración de la solución de AOT fue 25 mM y en el caso de Tween-20, de 2.5 mM y la relación de ambos 10:1. RESULTADOS Actividad enzimática: Los valores de actividad obtenidos a distintas concentraciones de AL y valores de pH fueron aproximadamente un orden de magnitud mayores cuando se utilizaron micelas directas respecto a micelas inversas de AOT/isooctano, siendo las de éstas a su vez aproximadamente 2 veces mayor respecto a las del sistema formado por AOT/Tween-20/isooctano/agua para una proporción AOT/Tween-20 de 10:1. Con respecto al contenido de agua adicionado a ambos sistemas micelares inversos, el constituido por AOT/isooctano/agua permitió valores mayores de W incrementándose a su vez actividad enzimática respecto al sistema AOT/Tween-20/isooctano/agua. Se continúa trabajando en determinar la actividad de LOX para distintas relaciones entre los surfactantes AOT/Tween-20. CONCLUSION En todos los casos la actividad enzimática en sistemas micelares inversos fue menores que en sistemas directos. En ambos sistemas la enzima es capaz de interactuar sobre su sustrato específico induciendo su oxidación, resultando la reacción altamente dependiente de la concentración de sustrato, del grado de hidratación y del valor de pH del medio. En el sistema AOT/isooctano/agua, la actividad se incrementa cuanto más elevado es el contenido de agua. En sistemas de micelas directas el pH óptimo de actividad tiene un valor de 9, mientras que en micelas inversas se observó mayor actividad a valores de pH comprendidos entre 10 y 11. Se continúa trabajando en determinar la actividad de LOX para distintas relaciones entre los surfactantes AOT/Tween-20. CONCLUSION En todos los casos la actividad enzimática en sistemas micelares inversos fue menores que en sistemas directos. En ambos sistemas la enzima es capaz de interactuar sobre su sustrato específico induciendo su oxidación, resultando la reacción altamente dependiente de la concentración de sustrato, del grado de hidratación y del valor de pH del medio. En el sistema AOT/isooctano/agua, la actividad se incrementa cuanto más elevado es el contenido de agua. En sistemas de micelas directas el pH óptimo de actividad tiene un valor de 9, mientras que en micelas inversas se observó mayor actividad a valores de pH comprendidos entre 10 y 11. Se continúa trabajando en determinar la actividad de LOX para distintas relaciones entre los surfactantes AOT/Tween-20. CONCLUSION En todos los casos la actividad enzimática en sistemas micelares inversos fue menores que en sistemas directos. En ambos sistemas la enzima es capaz de interactuar sobre su sustrato específico induciendo su oxidación, resultando la reacción altamente dependiente de la concentración de sustrato, del grado de hidratación y del valor de pH del medio. En el sistema AOT/isooctano/agua, la actividad se incrementa cuanto más elevado es el contenido de agua. En sistemas de micelas directas el pH óptimo de actividad tiene un valor de 9, mientras que en micelas inversas se observó mayor actividad a valores de pH comprendidos entre 10 y 11.