Diacilglicerol induce la síntesis continua de fosfatidilinositol 4,5-bifosfato activando proteinquinasa C y fosfolipasa D1 durante la exocitosis acrosomal.

PELLETAN, LEONARDO E; SUHAIMAN, LAILA; VAQUER, CINTIA CELINA; DE BLAS, GERARDO A; MAYORGA, LUIS S; BELMONTE, SILVIA A

Mendoza

Jornada; XI Jornadas Virtuales de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas ? Universidad Nacional de Cuyo.; 2012

Facultad de Ciencias Medicas. Universidad Nacional de Cuyo

INTRODUCCION y OBJETIVOSLa cabeza del espermatozoide contiene una gran vesícula secretoria denominada acrosoma. La fusión de la membrana acrosomal externa de esta vesícula con la membrana plasmática constituye una exocitosis regulada, calcio dependiente, que se denomina reacción acrosomal (RA). El mecanismo molecular de la RA conocido hasta el momento indica que esta se inicia por la unión de glicoproteínas de la zona pelúcida ovocitaria (ZP) a receptores ubicados en la superficie del espermatozoide. ZP3 causa un aumento inicial y transitorio de calcio citosólico (a través de canales de calcio voltaje dependientes, VOCCs) que activa la fosfolipasa C (PLC). PLC hidroliza PIP2 produciendo inositol-1,4,5-trifosfato (IP3) y diacilglicerol (DAG). IP3 abre canales de calcio sensibles a IP3 presentes en depósitos intracelulares de calcio como el acrosoma, mientras que DAG activa proteínas que poseen dominios C1.DAG y sus análogos, los esteres de forbol (PMA), inducen RA en espermatozoides de diferentes especies. Este lípido juega un rol fundamental en eventos que conducen a la fusión de membranas durante la exocitosis pero su mecanismo de acción todavía no se conoce.El objetivo de este trabajo fue explorar si el DAG cumplía un rol adicional luego de la apertura de canales de calcio de la membrana plasmática. Para ello usamos un método de permeabilización controlada de dicha membrana con estreptolisina O que imita la apertura de los canales de calcio y agregamos DAG para estudiar su efecto en la exocitosis en ausencia de calcio extracelular.MÉTODOS: Se utilizaron muestras de semen humano de dadores normospérmicos. Las células fueron utilizadas para realizar ensayos funcionales en espermatozoides permeabilizados, mediciones de calcio en célula única, Western blot, inmunofluorescencia indirecta, medición de la actividad de PLD, síntesis de PIP2 (TLC) y ensayos de pull down.RESULTADOS Y CONCLUSIONESDAG está involucrado en etapas posteriores a la apertura de los canales de calcio de la membrana plasmática durante la RAPara determinar si el DAG o PMA, tenían alguna función luego de la apertura de canales de calcio en la membrana plasmática, indujimos la formación de poros en la misma, imitando dichos canales y agregamos estos estímulos en ausencia de calcio en el medio. Ambos indujeron la exocitosis acrosomal. Para evaluar si el calcio acrosomal era requerido para la exocitosis inducida por DAG/PMA utilizamos dos inhibidores específicos de canales de calcio sensibles a IP3: xetospongina C y 2-APB. Ambos inhibieron la exocitosis disparada por PMA (Imagen 1. A, B). Por lo tanto en espermatozoides permeabilizados, el calcio extracelular es prescindible para la exocitosis acrosomal estimulada por DAG o PMA aunque la salida de calcio desde el acrosoma a través de canales de calcio sensibles a IP3 es absolutamente necesaria.Para comprobar que el DAG inducia salida de calcio acrosomal inhibimos la exocitosis con toxina botulínica E (BoNT/E) que cliva SNAP25, proteína fundamental en la exocitosis. Cargamos las células con Fluo-3AM, una sonda de calcio fluorescente permeable a membranas. Los cambios en la concentración de calcio intracelular se determinaron en célula única en tiempo real. (Imagen 1C, D, E). Nuestros resultados indican que DAG promueve la liberación de calcio del reservorio acrosomal a través de canales de calcio sensibles a IP3.DAG induce la activación de PLD1 por PKC durante la RA y la síntesis de ácido fosfatídico (PA)Hipotetizamos que DAG podría estar activando alguna PKC por unión a su dominio C1. La exocitosis inducida por DAG se inhibió cuando tratamos previamente las células permeabilizadas con inhibidores de PKC (cheleritrina y Ro-31-7549) indicando que esta kinasa se activa durante la exocitosis. En algunos sistemas celulares PKC activa PLD pero en otros PLD activa PKC. Quisimos saber que ocurría en nuestro modelo. Detectamos la presencia de PLD1 en espermatozoides por Western blot y su localización por inmunofluorescencia indirecta. (Imagen 2 A y B). Para saber si PLD1 era necesaria para la exocitosis inducida por DAG utilizamos distintos inhibidores de la enzima (CAY10593, 1-butanol, antiPLD1, PABD) previo al estímulo. Todos inhibieron la exocitosis. Tanto para PKC como para PLD la inhibición de la RA pudo ser revertida por la adición de PA, producto de la actividad de PLD (Imagen 2 C) indicando no solo que DAG requiere de PLD1 y de PKC para disparar RA sino que PKC esta activando PLD en la cascada de transducción de señales que conducen a la exocitosis. También medimos la actividad de PLD en espermatozoides humanos y observamos que esta aumentaba frente al estímulo de DAG (Imagen 2 D).La exocitosis inducida por DAG requiere la síntesis de PIP2En espermatozoides humanos, AMPc estimula Epac (exchange protein directly activated by cAMP) quien activa PLC, produciendo IP3 que moviliza calcio del acrosoma llevando a la exocitosis. Hipotetizamos que DAG promovía la síntesis de PIP2, generando el sustrato de PLC y cerrando un ciclo de retroalimentación positiva para producir continuamente DAG e IP3. Por lo tanto si secuestrábamos PIP2 pensamos se inhibiría la exocitosis inducida por DAG. Para probar este razonamiento tratamos las células con dominio PH de PLCδ1 y anti- PIP2. Ambos bloquearon le exocitosis inducida por DAG. Lo mismo ocurrió cuando inhibimos PLC (U73122, edelfosina). La inhibición fue revertida por PIP2 al igual que la de PLD y PKC sugiriendo que DAG induce un aumento de PIP2 requerido para la exocitosis. (Imagen 3 A). Logramos demostrar que DAG induce la síntesis de PIP2 usando TLC (Imagen 3 B).DAG/PMA activan Rab3A durante la RAPara inducir la RA se requiere la activación de dos vías de transducción de señales: una que lleva a la síntesis de DAG e IP3 y otra que conduce a la activación de proteínas involucradas en fusión de membranas (Rab3A, NSF, SNAREs, complexina, sinaptotagmina). Estudiamos la proteína Rab3A, que es la que se activa más temprano en la vía descripta hasta el momento. Evaluamos si DAG era capaz de activar Rab3A. Utilizamos la proteína Rab3A permeable que se incorporó a espermatozoides intactos antes de ser estimulados con: A23187, DAG o PMA. Con las células lisadas realizamos un ensayo de pull down usando el dominio RIM-RBD (une solo Rab3A en su forma activa). DAG o PMA activaron Rab3A (Imagen 4 A). Por lo tanto proponemos que luego del ingreso de calcio a través de canales de membrana DAG, PIP2 y PA actúan como lípidos fundamentales que modulan la producción de IP3 y la activación de Rab3A. Presentamos nuestro modelo de trabajo en la Imagen 4B.