La actividad de esfingosina quinasa es requerida en una nueva vía de señalización que conduce a la exocitosis acrosomal del espermatozoide humano

SUHAIMAN, LAILA; GINER, FEDERICO; PELLETAN, LEONARDO E; DE BLAS, GERARDO A; MAYORGA, LUIS S; BELMONTE, SILVIA A

Mendoza

Jornada; - XI Jornadas Virtuales de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas; 2010

Facultad de Ciencias médicas. Universidad Nacional de Cuyo

La actividad de esfingosina quinasa es requerida en una nueva vía de señalización que conduce a la exocitosis acrosomal del espermatozoide humano Introducción: Los esfingolípidos constituyen una numerosa clase de lípidos de células eucariotas y bacterianas, que forman parte de microdominios ricos en colesterol, están involucrados en transducción de señales y procesos fisiopatológicos (1;2;3). Ceramida, esfingosina y esfingosina 1-fosfato (S1P) han sido propuestos como moléculas reguladoras de la secreción de neurotransmisores (4). Células granulosas de cerebelo y astrocitos liberan S1P al medio, proponiendo un rol autocrino/paracrino para este esfingolípido (5), y en neuronas de hipocampo S1P produce secreción de glutamato (6). Sin embargo se desconoce el mecanismo molecular por el cual S1P afecta estos procesos. Por ese motivo nos centramos en el efecto ejercido por S1P y la enzima que la produce, esfingosina quinasa (SK), en la exocitosis regulada. Nuestro laboratorio demostró (ver trabajo: S1P induce aumento de la concentración de calcio intracelular y exocitosis acrosomal en espermatozoides humanos) que S1P induce reacción acrosomal (RA) activando receptores acoplados a proteína Gi, originando un aumento de calcio y activación de PLC, PKC y Rab3A.  En este trabajo intentamos dilucidar si la actividad de SK es requerida como parte del mecanismo molecular de la exocitosis. Objetivo: Caracterizar la función de los esfingolípidos y las enzimas que regulan su producción en la exocitosis regulada utilizando como modelo la RA -Determinar la presencia de SK -Dilucidar si SK participa en la transducción de señales que disparan RA. Metodología: Ensayos funcionales de RA: Se utilizaron espermatozoides permeabilizados con estreptolisina O (7;8;9) como no permeabilizados (10). El estado del acrosoma se evaluó según (11). Western blotting (WB): se analizaron proteínas electroforéticamente y electrotransferidas. Se usaron anticuerpos primarios y secundarios y se detectaron con el Analizador de Imágenes Luminiscentes-4000. Inmunofluorescencia Indirecta (IFI): Espermatozoides humanos fijados y permeabilizados se incubaron con anticuerpo primario anti-SK1 y secundario anti-rabbit Cy3. Se usó microscopio confocal Olympus. Mediciones de calcio intracelular: Se incubaron espermatozoides humanos con Fluo-3 AM. La excitación se realizó con luz estroboscópica (12). Fosforilación de lípidos con ATPγ32P: Se usó protocolo especificado por Anelli et al. (13) Resultados: Esfingosina es fosforilada por acción de SK par dar S1P. Sabiendo que S1P induce RA quisimos saber si SK estaba presente y activa en espermatozoides humanos. Determinamos la presencia de una banda con el peso molecular correspondiente a SK1 (43 kDa, fig.1A). Johnson y col. (14) demostraron que PMA induce fosforilación de SK mediada por PKC provocando su activación y localización en membranas. El WB mostró que PMA y A23187 incrementan la asociación de SK1 a membrana (fig.1B). En IFI de espermatozoides SK presenta tinción difusa en la cabeza de espermatozoides control (Fig.2 panel 2-APB), luego de un estímulo, observamos un cambio de localización hacia la región acrosomal (panel 2-APB -PMA). Esta modificación en la ubicación de la proteína podría significar que la misma participa en la RA. Para determinar si SK1 esta involucrada en la transducción de señales que llevan a la RA, utilizamos dos inhibidores: DMS y SKI en ensayos funcionales. Sabiendo que PMA dispara exocitosis en espermatozoides intactos (15), y que activa SK a través de PKC (14) pretratamos espermatozoides con DMS o SKI antes de agregar PMA. Ambos inhibieron parcialmente la RA disparada por PMA, y su efecto fue revertido por S1P (Fig.3A) demostrando que SK y S1P están implicadas en la transducción de señales disparada por DAG, reforzando la idea de que el espermatozoide podría generar S1P, ejerciendo efecto paracrino/autocrino. También medimos actividad de SK en espermatozoides tratados o no con PMA. La síntesis de S1P incrementó 2,5 veces en espermatozoides que recibieron el estímulo (fig.4B). Para conectar la activación de SK inducida por PMA y los efectos extracelulares de S1P pensamos que si PMA induce RA porque activa la síntesis de S1P, el tratamiento con toxina pertusis (TP, que inhibe proteína Gi, exocitosis inducida por S1P e incremento de calcio) debería bloquear la exocitosis inducida por PMA. TP (fig3C) inhibe la RA inducida por PMA indicando que la vía de PMA está conectada a la producción de S1P. Si PMA dispara exocitosis en espermatozoides intactos (fig.3A) y SK está involucrada en la cascada iniciada por PMA, pensamos que PMA incrementa el calcio intracelular y que podría ser bloqueado por un inhibidor de SK. PMA induce incremento de calcio en células vivas, el cual es inhibido cuando se preincubada con SKI (fig3D-F). Esto sugiere que la RA inducida por PMA incrementa el calcio intracelular que se basa en la síntesis de S1P por SK. Conclusiones: SK1 está involucrada en la producción de S1P por PMA controlando/regulando el nivel de este biomodulador. Diseñamos un modelo (Fig.4) donde la unión de S1P a un receptor acoplado a proteína Gi activa un canal VOC y PLC que hidroliza PIP2 para generar IP3 (conduce a la salida de calcio acrosomal y estimula apertura de canales SOC) y DAG (regula PKC fosforilando SK directamente (14), o indirectamente a través de ERK (16).SK activada se dirige a membrana plasmática donde fosforila esfingosina. La S1P puede transportarse por CFTR (cystic fibrosis transmembrane regulator 17) implicado en la internalización de S1P; y ABCC1 (18) y/o spns2 (19) que median la salida de S1P. Proponemos que S1P producida por el espermatozoide alcanza el medio extracelular a través de un transportador, interaccionando con su receptor y cerrando el ciclo de activación. No descartamos la posibilidad de que el ovocito secrete S1P al espacio extracelular, facilitando la RA.   Bibliografía 1. T.Ariga, etal J. Lipid Res. (2008). 2. Y.Hannun, L. Obeid, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. (2008). 3. W.Holland, S.Summers, Endocr. Rev. (2008). 4. T. Okada etal, Cell Signal. (2009). 5. V.Anelli etal J. Neurochem. (2005). 6. T.Kajimoto etal., Mol. Cell Biol. (2007). 7. S.Belmonte etal., Dev. Biol. (2005). 8. .DeBlas etal., J. Biol. Chem. (2002). 9. C.Roggero etal., Dev. Biol. (2005). 10. C.Lopez, etal FASEB J. (2007). 11. C.Mendoza etal J. Reprod. Fertil. (1992). 12. T.Nishigaki etal Biotechniques (2006). 13. V.Anelli etal J B C (2008). 14. K.Johnson etal JBC (2002). 15. C.O´Toole etal, Mol. Hum. Reprod. (1996). 16. S.Pitson etal., EMBO J. (2003). 17. E.Hernandez-Gonzalez etal., JBC (2007). 18. P. Mitra etal., PNAS (2006). 19.A.Kawahara etal., Science (2009)