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Esfingosina 1-Fosfato induce aumento de la concentración de calcio intracelular y exocitosis acrosomal en espermatozoides humanos Suhaiman, L ; Guerrero Gimenez, M ; Pelletán , LE ; De Blas, G ; Morales, A ; Mayorga , L ; Belmonte , SA Introducción: La fertilización es el proceso por el cual el ovocito y el espermatozoide se unen para generar un nuevo individuo (1). El espermatozoide contiene una vesícula secretoria denominada acrosoma. La fusión de la membrana de esta vesícula con la membrana plasmática constituye una exocitosis regulada, calcio dependiente, denominada reacción acrosomal (RA). La RA es un requerimiento para la penetración de la zona pelúcida y para la fertilización. Las vías descriptas para la RA convergen en proteínas conservadas que conducen a la fusión de membranas. Se conoce mucho de la maquinaria proteica involucrada en procesos de fusión de membranas (2-4), pero no se conoce cómo los lípidos se integran a este mecanismo. Nos centramos en el estudio del rol de esfingolípidos ya que estos tienen un papel importante en transducción de señales y secreción de neurotransmisores: células granulosas de cerebelo y astrocitos liberan esfingosina 1-fosfato (S1P) al medio, proponiendo un rol autocrino/paracrino para este esfingolípido (6), y en neuronas de hipocampo S1P produce secreción de glutamato regulando la transmisión sináptica (5,7). Sin embargo se desconoce el mecanismo molecular por el cual S1P afecta estos procesos. Objetivos Caracterizar la función de esfingolípidos en la exocitosis regulada utilizando como modelo la RA: 1) Caracterizar el rol de S1P en la RA del espermatozoide humano. 2) Definir la vía de transducción de señales disparada por S1P. Metodología: Ensayos funcionales de RA: Se utilizaron espermatozoides permeabilizados con estreptolisina O (3, 8, 9) y no permeabilizados (10). El estado del acrosoma se evaluó según (11). Mediciones de calcio intracelular en célula única: Se incubaron espermatozoides humanos con una sonda fluorescente sensible a cambios en concentración de calcio: Fluo-3 AM. La excitación se realizó con luz estroboscópica (12). Resultados: S1P está descrito como segundo mensajero intracelular (13), ligando para receptores acoplados a proteína G (14) y puede traslocar a través de la bicapa lipídica mediante una proteína transportadora (15). No se conoce si estas moléculas lipídicas intervienen en la exocitosis regulada. Para determinar si S1P es capaz de inducir la RA, tratamos células permeabilizadas e intactas con concentraciones crecientes de S1P y evaluamos RA. No se observó efecto en gametas permeabilizadas. Sin embargo S1P induce RA en espermatozoides no permeabilizados (intactos, Fig.1A), sugiriendo que este lípido actúa a través de un receptor de membrana en espermatozoides intactos. La RA inducida por S1P fue inhibida por BAPTA (quelante de calcio) sugiriendo que la exocitosis inducida por este lípido depende del ingreso de calcio extracelular, activando la apertura de canales de calcio (10, Fig.1B). Considerando que la RA inducida por S1P requiere ingreso de calcio extracelular, indagamos los canales involucrados. Utilizamos inhibidores de canales de calcio voltaje dependiente: Verapamilo y Nifedipina; inhibidores de canales activados por reservorios SKF-96363, YM-58483 y Ni2+; e inhibidores de canales de calcio sensibles a IP3: 2-APB y xestospongina C Todos inhibieron la RA inducida por S1P (Fig.1C). Para determinar si S1P incrementa el calcio intracelular en células vivas, se cargaron espermatozoides con Fluo-3 AM. Las variaciones en la concentración de calcio se detectaron en célula única (Fig.2, movie 1). Aproximadamente el 45% de las células registró incremento en [Ca2+]i. En otros tipos celulares se han descripto receptores a S1P. Algunos de ellos se asocian a proteínas G (14). En espermatozoides humanos se han encontrado proteínas Gi (16). Nos preguntamos si S1P inducía exocitosis a través de un receptor acoplado a proteína Gi. Toxina pertusis (TP) fue capaz de inhibir la RA estimulada por S1P (Fig.3A, movie 2). TP también inhibió el incremento de calcio inducido por S1P en espermatozoides humanos (Fig.3 comparar B con C). Esta es la primera evidencia que sugiere que S1P dispara RA en espermatozoides humanos a través de receptores acoplados a proteína Gi. Habiendo determinado que un receptor de membrana para S1P podría estar involucrado en la RA indagamos la cascada de señalización activada por el receptor. Utilizamos inhibidores de enzimas que intervienen la RA: U73122 (inhibidor PLC), U73343 (análogo inactivo de U73122), Edelfosina (inhibidor PLC), Queleritrina (inhibidor PKC) y R-Rab3A no prenilada, cargada con GDPbetaS (inhibidor de RA 10). Posteriormente se adicionó S1P. Todos los tratamientos inhibieron la RA disparada por S1P, sugiriendo que este esfingolípido requiere la actividad de PLC, PKC y Rab3A (Fig. 3G). Conclusiones: Nuestros resultados nos permitieron diseñar un modelo de trabajo (Fig.4) donde la unión de S1P a un receptor acoplado a proteína Gi activa un canal VOC. Tanto el incremento transitorio de calcio como la proteína Gi activa conducen a la activación de PLC que hidroliza PIP2 generando IP3 y DAG. IP3 libera calcio del acrosoma y estimula la apertura de canales SOC disparando la exocitosis. Por otro lado DAG activa PKC que fosforila proteínas que intervienen en exocitosis (3). Estos resultados nos permiten proponer un nuevo rol para S1P: inductor de la exocitosis regulada por calcio. También nos llevan a preguntarnos cual es el rol fisiológico del lípido y si este es producido por el ovocito o por el espermatozoide. En este último caso el esfingolípido sería transportado al medio extracelular y cumpliría un rol autocrino/paracrino. Una de estas hipótesis es evaluada en el trabajo presentado en estas jornadas: La actividad de esfingosina quinasa es requerida en una nueva vía de señalización que conduce a la exocitosis acrosomal del espermatozoide humano. Bibliografía 1. R. Yanagimachi, Physiology of Reproduction,1994 2. C.Tomes et al., Mol. Hum. Reprod. 2005 3. C.Roggero et al., Dev. Biol. 2005 4. L Mayorga et al, IUBMB. Life 2007 5. T. Okada et al., Cell Signal. 2009 6. V. Anelli et al., J. Neurochem. 2005 7. T. Kajimoto et al., Mol. Cell Biol.2007 8. S. Belmonte et al., Dev. Biol. 2005 9. G. De et al., JBC. 2002 10. C. Lopez et al., FASEB J 2007 11. C. Mendoza et al. J. Reprod. Fertil. 1992 12. T. Nishigaki et al., Biotechniques 2006 13. M. Mattie, G et al. JBC. 1994 14. T. Taha et al., Biochim. Biophys. Acta 2004 15. L. Boujaoude et al., JBC 2001 16. G.. Kopf, Prog. Clin. Biol. Res 1988

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