CONSTRUCCIÓN DE UN NUEVO TRANSPOSÓN MINI-Tn5 PORTADOR DE UN ORIGEN DE REPLICACIÓN BACTERIANO PARA SU USO EN ESTUDIOS RIVET EN RIZOBIOS.

SALAS, E.; LOZANO M; MARTINI, C.; SALTO, I.; TORRES TEJERIZO, G.A.; GIUSTI, M. A.; DEL PAPA M. F; PISTORIO, M.; LAGARES, A.

Buenos Aires, Argentina

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiologia; 2010

Asociacion Argentina de Microbiologia

Introducción: Los rizobios son bacterias gram-negativas quehabitan el suelo y se caracterizan por fijar nitrógeno atmosféricocuando se asocian en simbiosis con plantas leguminosas. Dichaasociación es el resultado de un conjunto de eventos de señalizacióncuyos genes asociados no han sido aun del todo caracterizados.La técnica RIVET (Recombination based In VivoExpression Technology) permite identificar genes que, en unacondición particular, se expresan de modo diferencial respecto deuna condición fisiológica de referencia. En nuestro laboratorio seha desarrollado una variante de la técnica RIVET que usa untransposón derivado del Tn5 como herramienta para generar fusionestranscripcionales a lo largo del genoma al gen de unaresolvasa (tnpR) localizada en un extremo del transposón. Laexpresión de TnpR en clones específicos resultará en la escisiónde un cassette de DNA que cambiará el fenotipo de la bacteriaindicando que el gen fusionado a la resolvasa en dicho clon seha expresado. Objetivos: Construcción de un nuevo mini-Tn5 portadorde un origen de replicación (oriV) bacteriano funcional enEscherichia coli que facilite la recuperación de secuenciasflanqueantes al transposón en clones que resulten de interés luegode la aplicación de la técnica RIVET. Materiales y Métodos: Mediosde cultivo complejos TY, LB. Conjugaciones bacterianas siguiendoprotocolos clásicos. Técnicas moleculares según Maniatiset al. (1982). Resultados: Se clonó un origen de replicación funcionalen E. coli proveniente del plásmido pSM10 dentro del sitioNotI presente en un transposón mini-Tn5, haciendo uso deoligonucleótidos como adaptadores, dando como resultado elplásmido llamado pRIVET-miniTn5-ori. Teniendo en cuenta queel vector pRIVET-miniTn5 no posee capacidad de replicarse encepas de E. coli que no poseen la proteína pi, la recuperación declones que poseen el oriV clonado dentro del sitio NotI del vectorse realizó mediante la selección de aquellos clones que poseíanla capacidad de crecer en un medio selectivo conteniendotetraciclina, resistencia codificada por el vector. Los clones obtenidosfueron verificados por su fenotipo, su patrón de restriccióny su secuencia. Para la nueva herramienta RIVET analizamos lacapacidad de transposición en Sinorhizobium meliloti y la funciona-lidad de la resolvasa codificada por el transposón. Conclusiones: Hemos construido un nuevo transposón portador de un oriVfuncional en E. coli. Hemos verificado que la nueva construcciónmantiene la capacidad de transponer en S. meliloti y que, comoes esperable, en muchas de sus inserciones da lugar a escisionesdel cassette de DNA blanco de TnpR. El sistema presentadoes el primero en su tipo, y constituye una herramienta práctica muyeficiente para generar fusiones génicas a tnpR para estudiosRIVET evitando la construcción de bibliotecas genómicas de fusiónen vectores plasmídicos.