CONSTRUCCIÓN Y EVALUACIÓN DE UN SISTEMA REPORTERO PARA ESTIMAR LA TRANSFERENCIA CONJUGATIVA DE RHIZOBIUM FAVELUKESII LPU83

JULIET NILSSON; ABRIL LUCHETTI; MARIANO PISTORIO; LUCAS CASTELLANI; GONZALO A. TORRES TEJERIZO

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; XIV Congreso Argentino de Microbiología General (XIV SAMIGE); 2019

Introducción y Objetivos: Los rizobios son bacterias que interaccionan simbióticamente con las raíces deplantas leguminosas. Durante esta interacción, estas bacterias son capaces de transformar el nitrógeno (N) delaire en amonio. Los cultivos agronómicos dependen de los niveles de N en los suelos, por lo que se sueleaprovechar la capacidad fijadora de N de los rizobios al utilizarlos como inoculantes para mejorar el rendimientode dichos cultivos. Sin embargo, poco sabemos de cómo la liberación masiva de estas bacterias afecta labiodiversidad de los suelos. La transferencia horizontal de genes es una de las mayores fuerzas que contribuyea la diversificación y adaptación bacteriana, siendo la transferencia conjugativa (TC) uno de los factores másimportantes. pLPU83a, un plásmido de Rhizobium favelukesii LPU83, es capaz de transferirse por conjugación,evidenciando un mecanismo de regulación de su TC que depende del regulador transcripcional TraR, pero no deAcil-homoserin lactonas. Esto hace a pLPU83a un buen candidato para el estudio de nuevos mecanismos deregulación de la TC. El objetivo de este trabajo es la construcción de un sistema reportero que nos permitaevaluar la expresión de genes involucrados en la TC mediante medidas de fluorescencia y correlacionar dichosvalores con la TC.Materiales y Métodos: Las conjugaciones fueron realizadas empleando la técnica de Simon (1989). Se midióla fluorescencia de los cultivos de las cepas en diferentes etapas de crecimiento y se relacionó con la densidadóptica (DO) a 600 nm, las UFC y la frecuencia conjugativa.Resultados: Se construyó un vector para realizar fusiones transcripcionales, en el cual puede clonarsecualquier promotor río arriba de la proteína verde fluorescente (GFP). En dicho vector se clonó el promotor delgen traR Y se transfirió a las cepas de R. favelukesii LPU83 silvestre y mutante en el gen pLPU83a0146, el cualmuestra un aumento en la frecuencia conjugativa. Mediante experimentos de transcriptómica, se observó queen dicho mutante la expresión de distintos genes involucrados en la TC se encontraba aumentada, siendo elgen del regulador traR el de mayor aumento. La relación entre fluorescencia y DO, en bacterias en faseexponencial, fue mayor en la cepa mutante que en la cepa silvestre, indicando una mayor expresión delgen traR. En condiciones de cultivo tardías, para la cepa salvaje, no se observó un incremento en la relaciónfluorescencia/densidad óptica, lo cual se corresponde con resultados reportados en nuestro grupo (Castellani etal., 2019).Conclusiones: Hemos observado que los datos obtenidos por transcriptómica se corresponden con aquellosobtenidos por una metodología más simple. Esto nos permitirá evaluar la expresión de otros genes involucradosen la TC y poder medir así la frecuencia conjugativa sin tener que recurrir a la técnica clásica de conjugación deplaqueos con antibióticos y recuento de bacterias viables