Estrategia para mejorar la eficiencia de transducción de AcMNPV en células de mamíferos.

FABRE, MA. LAURA; PIDRE, MATÍAS LUIS; ROMANOWSKI, VÍCTOR; AMOROS, LESLIE; URE, AGUSTIN

Encuentro; XXXIX REUNIÓN CIENTÍFICA ANUAL DE LA SOCIEDAD ARGENTINA DE VIROLOGÍA; 2019

Los baculovirus son virus específicos de artrópodos que poseen un genoma circular cerrado de doble cadena de ADN con tamaños que varían entre los 80 y 180 kpb. Estos virus son ampliamente utilizados para el desarrollo de terapias génicas, ya que poseen la capacidad de ingresar a las células de mamíferos y expresar genes foráneos. El virus modelo utilizado es Autographa californica nucleopolyhedrovirus (AcMNPV) cuya eficiencia de transducción es muy diversa entre las diferentes líneas celulares de mamífero. El objetivo del presente trabajo consiste en obtener baculovirus pseudotipados para aumentar la eficiencia en el ingreso celular. Para ello, se ha desarrollado una línea celular transgénica de insecto que expresa constitutivamente la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV), que permitirá la incorporación de la proteína G en la membrana de los baculovirus propagados en las mismas.Se generó el plásmido de expresión pIP-VSVG a partir del clonado del ORF de VSV-G. Posteriormente, células de insecto High Five (Hi5) fueron transfectadas con el plásmido pIP-VSVG y seleccionadas con puromicina para la obtención de la línea monoclonal Hi5-VSVG. Para los ensayos de transducción, AcMNPV-dtomato fue amplificado en células Hi5-wild type (Hi5-wt) y en Hi5-VSVG. Los sobrenadantes de infección se centrifugaron 1h a máxima velocidad y luego se incubaron en distintos tipos celulares de mamífero durante 2 ½ hs a temperatura ambiente. Finalmente, se observaron los resultados por microscopía de fluorescencia. Las células Hi5-VSVG fueron analizadas por inmunofluorescencia, utilizando un anticuerpo primario anti VSVG seguido de una incubación de 1 hora con un anticuerpo secundario anti-rabbit-Cy3. Los resultados fueron analizados por microscopía confocal.Se generó la línea celular de insecto monoclonal Hi5-VSVG y la expresión de la  glicoproteína G de VSV y su localización en la membrana celular se verificó por inmunofluorescencia. Los ensayos de transducción se realizaron en células humanas de adenocarcinoma de pulmón (A549) con el virus AcMNPV-dtomato propagado en células Hi5-wt (control) ó en células HI5-VSVG. Se observó un aumento significativo en la eficiencia de transducción utilizando el virus amplificado en células Hi5-VSVG comparado con el control. Paralelamente, se ensayaron las mismas condiciones en células de riñón de embrión humano (HEK 293T) y en células epiteliales de riñón de mono (Vero) en los que no se observaron diferencias significativas en las eficiencias de transducción.A partir de este trabajo, hemos generado una línea celular transgénica de insecto que  permite la generación de baculovirus pseudotipados con la glicoproteína G de VSV. El virus propagado en esta línea celular ha demostrado ser más eficiente que el virus propagado en células de insecto wild type en ciertas líneas celulares de mamífero. Esta plataforma nos permitirá aumentar el tropismo de los baculovirus para su aplicación como vectores para terapia génica.