Mejoramiento del baculovirus de Anticarsia gemmatalis como agente de control biológico mediante la incorporación de proteínas heterólogas en los cuerpos de oclusión

ROMANOWSKI, VÍCTOR; MASSON, TOMÁS; FABRE, MARÍA LAURA

Complejo Hotel Vaquerías (UNC), Valle Hermoso, Córdoba

Congreso; XXXVIII Reunión Científica Anual de la Sociedad Argentina de Virología [SAV 2018]; 2018

SAV-AAM

El virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) ha sido utilizado con éxito en países con climas cálidos para el control biológico de la oruga de las leguminosas, una plaga que ocasiona daños importantes en el cultivo de soja. Sin embargo, su velocidad de acción lenta en climas templados limita su aplicación en países como Argentina. En este trabajo se propone una estrategia novedosa basada en la producción de cuerpos de oclusión (OB: occlusion body) de baculovirus en líneas celulares transgénicas que expresan proteínas heterólogas candidatas dirigidas a incorporarse en trans en el cuerpo de oclusión de AgMNPV. Esta estrategia evita la modificación genética del baculovirus, y presenta la ventaja de incorporar las proteínas de forma activa en el OB, pudiendo ejercer su acción de un modo inmediato al momento de su disolución en el intestino del insecto. Para ello, se incorporarán proteínas insecticidas direccionadas al OB mediante la fusión a la proteína de la envoltura del poliedro del virus (PEP) de AgMNPV. De esta manera, los OB actúan como portadores de proteínas que colaboran con la degradación de la membrana peritrófica en el intestino del insecto (proteasas, quitinasas), y/o afectan al sistema nervioso de la larva (toxinas específicas). Para ello, se utilizó el vector pIP/V5His derivado del vector comercial pIB/V5His (Invitrogen), el cual permite la expresión de un gen heterólogo bajo el control del promotor viral temprano constitutivo, POie2. Este vector contiene el gen que confiere resistencia a puromicina (pac), para la generación de líneas celulares transgénicas. El ORF de pep de AgMNPV fue amplificado por PCR y clonado en el pGEM-T Easy y luego, subclonado en el vector pIP. Los cebadores utilizados incorporaron sitios de restricción que permiten la fusión de polipéptidos en fase en el extremo N-terminal de PEP. Estos sitios, se utilizaron para el clonado del gen indicador gfp, el cual fue amplificado por PCR y clonado en el pGEM-T Easy. La línea celular de insecto policlonal UFLAg-eGFPPEP se seleccionó con puromicina por 15 días y se procedió al aislamiento clonal por dilución terminal. Finalmente, la línea monoclonal se infectó con el virus AgMNPV y AcMNPV-dsRED en dos experimentos independientes. La expresión del polipéptido GFP:PEP en las células monoclonales y en los OB purificados se verificaron por microscopía de fluorescencia confocal y por SDS-PAGE (10%), transferidas a membranas de PVDF e incubadas con el anticuerpo primario (anti-GFP) y secundario (anti-rat-HRP). Aún resta avanzar en la generación de las fusiones quiméricas con diferentes proteínas insecticidas y sus respectivos bioensayos.