MEJORAMIENTO DEL BACULOVIRUS DE ANTICARSIA GEMMATALIS COMO AGENTE DE CONTROL BIOLOGICO MEDIANTE LA INCORPORACION DE PROTEÍINAS HETEROLOGAS EN LOS CUERPOS DE OCLUSION

FABRE, MA. LAURA; MASSON, TOMAS; ROMANOWSKI, VÍCTOR

Congreso; XI I Congreso Argentino de Virologia, V Simposio de Virologia, Clínica I, II Simposio de Virologia Veterinaria; 2017

Asociacion Argentina de M icrobiologia

p { margin-bottom: 0.25cm; direction: ltr; color: rgb(0, 0, 10); line-height: 120%; text-align: left; }p.western { font-family: "Liberation Serif",serif; font-size: 12pt; }p.cjk { font-family: "Noto Sans CJK SC Regular"; font-size: 12pt; }p.ctl { font-family: "FreeSans"; font-size: 12pt; }El virus dela poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsiagemmatalis(AgMNPV) ha sido utilizado con éxito en países con climas cálidospara el control biológico de la oruga de las leguminosas, una plagaque ocasiona daños importantes en el cultivo de soja y otrasleguminosas. Sin embargo, su velocidad de acción lenta en climastemplados limita su aplicación en países como Argentina. En estetrabajo se propone una estrategia novedosa basada en la producciónde cuerpos de oclusión (OB: occlusionbody)de baculovirus en líneas celulares transgénicas que expresanproteínas heterólogas candidatas dirigidas a incorporarse en transenel cuerpo de oclusión de AgMNPV. Esta estrategia evita lamodificación genética del baculovirus, y presenta la ventaja deincorporar las proteínas deforma activaen el OB, pudiendo ejercer su acción de un modo inmediato al momentode su disolución en el intestino del insecto. Para ello seincorporarán proteínas insecticidas direccionadas al OB mediante lafusión a la proteína de la envoltura del poliedro del virus (PEP)de AgMNPV, o a la metaloproteasa Enhancin1 (E1) del virus de lapoliedrosis nuclear múltiple de Lymantriadispar(LdMNPV). De esta manera, los OB actúan como portadores de proteínasque colaboran con la degradación de la membrana peritrófica en elintestino del insecto (proteasas, quitinasas), y/o afectan al sistemanervioso de la larva (toxinas específicas). Para ello, seamplificaron por PCR y se clonaron en el vector pGEM-T EasyTMlos marcos de lectura abiertos de pepy enhancin1utilizandocomo molde el DNA genómico de AgMNPV y LdMPNV, respectivamente. Loscebadores utilizados incorporaron sitios de restricción que permitenla fusión de polipéptidos fase en el extremo N terminal de PEP. Enuna primera aproximación, los sitios de restricción incorporadosse utilizaron para el clonado del gen indicador GFP. Los diferentesmarcos de lectura quiméricos se clonaron en un vector de expresiónderivado del plásmido comercial (pIB/V5-HisTM).Parala facilitar la selección de cultivos celulares transgénicos seincorporó un gen que confiere resistencia a puromicina (pac)en el vector que se denominó pIP. Con las construcciones pIP-GFP:E1y pIP-GFP:PE se transfectaron células High FiveTM(Hi5) y se procedió a la selección de dos líneas celularespoliclonales: Hi5-GFP:PEP y Hi5-GFP:E1. A continuación, seinfectaron estas células con el virus AgMNPV salvaje y sepurificaron los OB. Además, se infectó con el virus modelo de lapoliedrosis nuclear múltiple de Autographacalifornica (AcMNPV)como prueba concepto para determinar la incorporación de lasproteínas quiméricas heterólogas, que permitan ampliar el uso dela plataforma celular bioinsecticida. Finalmente, se purificaron losOB y se evaluó la presencia de GFP mediante microscopía defluorescencia.Aúnresta avanzar en la generación de las fusiones quiméricas condiferentes proteínas insecticidas y sus respectivos bioensayos.