Análisis sistemático de diguanilato ciclasas de Bordetella bronchiseptica

GUTIÉRREZ M. PAZ; BELHART, KEILA; ZACCA FEDERICO; SISTI, FEDERICO

Rosario, Santa Fe

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología y XIV Congreso Argentino de Microbiología ALAM-CAM 2016; 2016

Asociación Argentina de Microbiología; Asociación Latinoamericana de Microbiología

El segundo mensajero c-di-GMP (cdG) es un regulador de diferentes fenotipos en numerosas bacterias. La concentración intracelular de cdG en la bacteria varía según la situación fisiológica. Altas concentraciones de cdG inducen la formación de biofilm y producción de exopolisacáridos, mientras que su disminución permite la movilidad de la bacteria y una vida libre.La concentración de cdG es regulada por estímulos extra e intracelulares a través de la activación o inhibición de dos tipos de enzimas. Las fosfodiesterasas específicas para degradar cdG (PDE) disminuyen la concentración de cdG estimulando la movilidad. Por otro lado la activación de diguanilato ciclasas (DGC) aumentan la concentración de este segundo mensajero. Un análisis de los genomas bacterianos disponibles revela la existencia de PDEs y DGCs en la mayoría de los genomas. Esto ha sido además corroborado en estudios funcionales de numerosos microorganismos.En nuestro grupo nos hemos dedicado a caracterizar el rol de cdG en el patógeno respiratorio Bordetella bronchiseptica. Al igual que otras bacterias, cdG regula tanto la formación de biofilm como la movilidad de B. bronchiseptica. En el presente trabajo hemos avanzado sobre la caracterización de tres DGC presentes en el genoma de B. bronchiseptica (BdcB, BdcC y BdcD). Para ello se han clonado cada uno de los genes que codifican para esas posibles DGC en un vector. Estas construcciones fueron introducidas en Pseudomonas fluorescens D4 (PfD4) con una deleción en cuatro DGC lo que le otorga un fenotipo deficiente en la formación de biofilm. En trabajos anteriores hemos demostrado que la complementación con una DGC heteróloga activa permite restaurar el fenotipo formador de biofilm. Al introducir BdcB y BdcC la formación de biofilm de PfD4 se recupera (en un 59% y 64% para BdcB y BdcC respectivamente respecto a la complementación con una DGC homóloga control), indicando una posible actividad DGC para estas proteínas. La actividad fue confirmada también al analizar la capacidad de nado. PfD4 presenta halos de movilidad en agar blando. Estos halos se ven disminuidos si se expresa en estas bacterias BdcB o BdcC. Una de las probables DGC, BdcB, fue subclonada en un vector replicativo en B. bronchiseptica a fin de determinar los fenotipos regulados por esta proteína. Esta DGC es la única que presenta una expresión de manera coordinada con la expresión de factores de virulencia, por lo cual resulta de particular interés. Ensayos en agar blando muestran que la movilidad de B. bronchiseptica expresando BdcB está fuertemente inhibida, lo que corresponde a una actividad DGC propuesta para esta proteína. En el presente trabajo hemos iniciado la caracterización de tres proteínas con posible actividad DGC. Esto nos permite consolidar el rol del segundo mensajero cdG en la fisiología de B. bronchiseptica y avanzar sobre la determinación de su rol durante el desarrollo de infecciones por parte de este patógeno.