Baculovirus como vector de terapia génica contra tumores pituitarios

M.F.GOTTARDO; V.ROMANOWSKI; M.CANDOLFI; M.PIDRE; A. SEILICOVICH

Buenos Aires

Congreso; XXXVI Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2016

Sociedad Argentina de Virología (SAV)

La humanina (HN) es un péptido aislado originalmente de cDNA de neuronas de un paciente con enfermedad de Alzheimer. Este péptido posee una acción citoprotectora en diferentes tipos celulares como neuronas, linfocitos y células germinales testiculares.Previamente hemos demostrado que la HN disminuye la apoptosis de células GH3, una línea de células pituitarias tumorales. En estudios preliminares se observó una sobreexpresión significativa de HN en estas células. Por ello surgió el interés de contar con un método que permita analizar el comportamiento de las células tumorales al silenciar la expresión endógena de HN.Para llevar a cabo dicho objetivo se diseñó un shRNA (short hairpin RNA) con parte de la secuencia del mRNA de la HN como blanco (target) y se sintetizó un cassette capaz de dirigir su expresión bajo el control del promotor U6. Además, para poder diferenciar las células transfectadas exitosamente, se incluyó en la construcción el gen indicador dTomato (proteína fluorescente roja) bajo el control del promotor del gen ie1 de citomegalovirus.Dada la capacidad transductora de los baculovirus en diferentes cultivos celulares y tejidos de vertebrados y su inocuidad debida a la incapacidad de replicar en dichos tipos celulares, se generó un baculovirus AcMNPV recombinante, capaz de vehiculizar el cassette de silenciamiento.Con el fin de evaluar el funcionamiento del sistema y el rol del silenciamiento de HN en células GH3, se clonó el cassette previamente descripto en el vector pUC57 generando el vector pUC57-shRNA(HN). Utilizando sitios de restricción incorporados durante el diseño, se generó el vector pUC57-shRNA(-) como control negativo. Al transfectar las células GH3 con estos plásmidos, se observó la expresión del gen indicador dTomato en un 32 % de las mismas. En aquellas células transfectadas con el plásmido pUC57-shRNA(HN) se observó una disminución en la intensidad de inmufluorescencia de HN comparada con las células transfectadas con el control pUC57-shRNA(-). Luego, se determinó la apoptosis (por TUNEL) de células transfectadas con pUC57-shRNA(HN). Las células transfectadas con el shRNA de HN presentaron más del doble del porcentaje de apoptosis que las células tratadas con el control. Estos resultados indican que la HN endógena tiene un rol antiapoptótico en células pituitarias tumorales.Luego, se clonó el cassette descripto previamente en el vector de transferencia pBacPAK9, que posee regiones de homología con el genoma del baculovirus AcMNPV y permite la generación de baculovirus recombinantes (recBV), por doble recombinación homóloga. Los recBV fueron capaces de transducir células GH3 murinas e inducir apoptosis en los cultivos celulares transducidos. El perfeccionamiento de esta estrategia permitirá evaluar el efecto del silenciamiento de HN en tumores pituitarios y su potencial uso para el tratamiento de este tipo de tumores a través de terapia génica.