Generación de baculovirus modificados para el estudio y mejoramiento de la actividad insecticida de virus de importancia agrícola.

M.L. FERRELLI, M. BIEDMA, R. SALVADOR, M. BERRETTA, A. SCIOCCO-CAP Y V. ROMANOWSKI

Buenos Aires, Argentina

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología; 2008

Sociedad Argentina de Virología

El nucleopoliedrovirus Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) y el granulovirus Epinotia aporema (EpapGV) poseen un gran potencial de utilización en el control de las plagas homónimas, como alternativa al uso de insecticidas químicos de amplio espectro. Aislamientos autóctonos de ambas especies virales, han sido caracterizados y evaluados como bioinsecticidas.  Su alta especificidad constituye una ventaja desde el punto de vista ecológico, pero una posible desventaja desde la óptica comercial. Ante ello, se han encarado una serie de estudios que apuntan a modificar genéticamente ambos baculovirus a fin de ampliar su rango de huéspedes y su virulencia, sin alterar su cualidad de inocuidad hacia organismos no blanco. Estos estudios demandan de un conocimiento detallado acerca del genoma de ambas especies virales, así como sobre su patogenicidad natural y ciclo biológico. En el presente trabajo se describe el diseño de estrategias y la generación de AgMNPV y EpapGV modificados, aplicables para tal fin. En una primera etapa, se construyeron un rAgMNPV(polh-) conteniendo el gen marcador Lac Z bajo el promotor de poliedrina y un rAgMNPV(polh+) en el cual se expresó EGFP bajo el control del mismo promotor. Se realizaron ensayos con dichos rAgMNPVs en  larvas de las principales especies de lepidópteros que atacan a la soja (Anticarsia gemmatalis, usada como control positivo; Epinotia aporema, Rachiplusia nu y Eulia sp.). Se detectó infección a partir de las 24 hs. p.i. en tejidos de larvas de A. gemmatalis y de R. nu, mientras que las larvas de E. aporema y Eulia sp. no resultaron susceptibles. En el caso particular de los granulovirus, como no se dispone de líneas celulares eficientes para su amplificación, se recurrió al diseño de una estrategia diferente. La misma se basa en la inserción del replicón miniF en el genoma de EpapGV con el objetivo de generar un bácmido replicable en E. coli, facilitando así su multiplicación y  manipulación genética. Existen evidencias que demuestran que la deleción del gen egt aumenta el poder insecticida de baculovirus. Por consiguiente, se construyó un plásmido de transferencia que permite dirigir la inserción del miniF en el gen egt de EpapGV, provocando la interrupción del mismo. La siguiente etapa será introducir este virus recombinante en larvas de E. aporema. Si bien se contaba con antecedentes acerca de infectividad del DNA desnudo de nucleopoliedrovirus, no se disponía de datos acerca de granulovirus. Por ello, se realizaron experimentos de transfección con DNA de EpapGV en larvas de E. aporema y se utilizó como modelo control el sistema DNA AgMNPV - larvas A. gemmatalis. Las larvas fueron transfectadas mediante  la inyección de mezclas de DNA-lípidos. La infección de los insectos se verificó por aparición de síntomas, observación de tejidos de larvas bajo microscopio óptico y por PCR.CONCLUSIONES: Se dispone de rAgMNPVs con genes marcadores los cuales, además de retener su capacidad infectiva, mostraron una alta expresión tanto en cultivos celulares como en larvas de insecto. El sistema de recombinación que permitió generar estos virus está siendo utilizado, además, para el estudio de la funcionalidad de genes seleccionados de EpapGV en AgMNPV. La propagación del DNA de EpapGV en E. coli simplificará la generación de mutantes sitio-específicos tanto para la realización de estudios básicos, como para el aumento de su actividad insecticida.