Generación de una línea celular transgénica que expresa el gen esencial 1629 del baculovirus de Anticarsia gemmatalis con proyección al desarrollo de un sistema de recombinación con alta eficiencia

ML FABRE, S HAASE, ML FERRELLI, ML PIDRE, V ROMANOWSKI

Buenos Aires

Congreso; XI Congreso Argentino de Virología - II Congreso Latinoamericano de Virología; 2015

Sociedad Argentina de Virología - Asociación Argentina de Microbiología

0359 - GENERACIÓN DE UNA LÍNEA CELULAR TRANSGÉNICA QUE EXPRESA EL GEN ESENCIAL 1629 DEL BACULOVIRUS DE ANTICARSIA GEMMATALIS CON PROYECCIÓN AL DESARROLLO DE UN SISTEMA DE RECOMBINACIÓN CON ALTA EFICIENCIAML Fabre, S Haase, ML Ferrelli, ML Pidre, V RomanowskiInstituto de Biotecnología y Biología Molecular (IBBM) UNLP-CONICET, Argentina.# IntroducciónEl virus de la poliedrosis nuclear múltiple de Anticarsia gemmatalis (AgMNPV) ha sido utilizado con éxito en países con climas cálidos para el control biológico de la oruga de las leguminosas, una plaga que ocasiona pérdidas en el cultivo de soja y otras leguminosas. Sin embargo, su velocidad de acción lenta en climas templados limita su aplicación en otros países como Argentina. Una herramienta que permite el mejoramiento de las propiedades insecticidas de los baculovirus consiste en la ingeniería genética de sus genomas, usualmente basada en la recombinación homóloga entre el virus y un vector de transferencia apropiado. La frecuencia de recombinación es muy baja y por eso la proporción de virus recombinantes suele ser menor al 1%, el aislamiento de virus modificados resulta muy laborioso y demanda mucho tiempo. Por esto, se han desarrollado sistemas de selección que permiten aumentar la proporción de virus recombinantes, algunos de ellos basados en la generación de virus deficientes en genes esenciales, incapaces de subsistir en células infectadas, que recuperan el gen eliminado al recombinar con un vector de transferencia. Para comenzar a abordar la generación de un sistema de recombinación de alta eficiencia para AgMNPV, se desarrolló una línea celular que permitirá el mantenimiento de un virus AgMNPV deficiente en el gen esencial 1629.# MetodologíaSe construyó un vector plasmídico para la generación de la línea celular transgénica que exprese constitutivamente el gen 1629, basado en el vector de selección pIB/V5-His. Se transfectaron células High Five con esta construcción y se aislaron clones de células transgénicas mediante un procedimiento de dilución terminal. La línea celular obtenida fue infectada con un bácmido de AcMNPV (virus de la poliedrosis múltiple de Autographa californica) deficiente en el gen 1629. Finalmente, se evaluó la producción de virus brotantes del bácmido en estas células infectando una línea celular (XXL-GFP) que posee un gen indicador bajo un promotor viral tardío.# Resultados.Se desarrolló la línea celular High Five-1629Ag que permite expresa el gen 1629 constitutivamente. Para analizar la complementación funcional de la línea transgénica, se infectaron, en una línea tituladora (XXL-GFP), los sobrenadantes de las células High Five-1629Ag y High Five, previamente transfectadas con el bácmido. Se observó fluorescencia sólo con el sobrenadante de High Five-1629Ag, indicando que el bácmido sólo puede formar viriones brotantes funcionales en estas células. Para la eliminar parte del gen 1629 de AgMNPV se co-transfectó el DNA genómico de este virus con un plásmido de transferencia. La recombinación homóloga entre ambos se verificó por la expresión de un gen indicador del vector (GFP).# Conclusiones.La línea celular transgénica generada permitió la complementación de un bácmido deficiente en el gen 1629 y podría utilizarse asimismo para el mantenimiento de un AgMNPV con una deleción en este gen.