Caracterización de la competitividad temprana de rizobios con tecnologías ómicas modernas. Diseño de estrategias orientadas a la mejora racional de las simbiosis.

SALAS EUGENIA; LOZANO MAURICIO; LÓPEZ JOSÉ LUIS; GIUSTI MARÍA DE LOS ÁNGELES; DRAGHI WALTER; ALBICORO, FRANCISCO JAVIER; MARTINI MARÍA CARLA; SALTO, ILEANA PAULA; TORRES TEJERIZO GONZALO; FORNASERO, LAURA VIVIANA; TONIUTTI, MARÍA; WIBBERG DANIEL; PUHLER ALFRED; SCHLÜTER ANDREAS; DEL PAPA MARÍA FLORENCIA; MARIANO PISTORIO; PARISI, GUSTAVO; BECKER, ANKE; LAGARES ANTONIO

Balcarce

Jornada; IV Jornadas bonaerenses de microbiología de suelos para una agricultura sustentable; 2014

Los rizobios son alfa-y beta- proteobacterias que habitan el suelo y pueden establecer simbiosis fijadoras de nitrógeno con leguminosas. Desde hace más de dos décadas en nuestro laboratorio hemos estudiado con herramientas diversas, y centrados en las simbiosis de rizobios con Medicago spp., la forma en que las bacterias interaccionan físicamente con su leguminosa huésped, el modo en que los rizobios responden y se adaptan a factores ambientales que modifican la simbiosis, y los mecanismos genéticos subyacentes a su evolución genómica en el mediano y largo plazo. Las asociaciones simbióticas son el resultado de un complejo diálogo molecular entre los rizobios y la planta huésped; como consecuencia del cual ambos se diferencian y dan lugar a un nuevo órgano, el nódulo radicular fijador de nitrógeno [1]. En estas asociaciones participan varios genes de ambos simbiontes que se expresan de modo secuencial y coordinado, de los cuales la mayoría de los que han sido caracterizados en el rizobio corresponden a aquellos que son cruciales para que la simbiosis tenga lugar (genes nod, exo, lps, entre otros [2]). Desde el punto de vista práctico, sin embargo, son muchos más los genes del rizobio que deben ser considerados a la hora de escoger cepas de buena performance para elaborar productos biofertilizantes. Además de ser infectivos y expresar buenas tasas de fijación de nitrógeno, los rizobios deben ser competitivos para abordar la raíz en presencia de otras bacterias y rizobios que están presente en el suelo y que no son necesariamente buenos simbiontes. La competencia entre cepas comienza en instancias tempranas de la colonización rizosférica, y sobre la base de aptitudes del rizobio aun no bien caracterizadas a nivel molecular. Lamentablemente, y por razones técnicas (escasas bacterias, material limitante para la extracción de RNA y ensayos con microarreglos, posibilidad de expresión transiente de genes, etc), la identificación de genes que moldean y condicionan la competencia temprana de los rizobios en el nicho rizosférico es difícil de abordar. Recientemente, utilizando tecnologías de alta capacidad de procesamiento y adecuadas para el estudio de interacciones bacteria-huésped (STM-Signature Tagged Mutagenesis, y RIVET-Recombination-based In Vivo Expression Technology [3]), hemos abordado la búsqueda sistemática de marcadores genéticos de los rizobios que participen en las etapas tempranas de la colonización radicular (percepción de la planta, uso de nutrientes, otros). Para ellos, brevemente, plantas de alfalfa crecidas en macetas con vermiculita y medio mineral fueron inoculadas, en ensayos paralelos, con diferentes mezclas (mezcla-1, ???mezcla-n) de aprox. 400 mutantes independientes mini-Tn5 de rizobios en una concentración total (baja) cercana a las 105 u.f.c./ml. Cada uno de los mutantes (400diferentes/mezcla), posee un transposón diferente etiquetado con dos secuencias nucleotídicas únicas (?firmas?) que permiten distinguir un transposón (un mutante) de otro en cualquiera de las mezclas [4, 5]. Así, cambios en la proporción de un dado mutante (?firma?) en el inóculo inicial respecto de su proporción en la rizósfera al final del ensayo; resultó indicativo de de modificaciones en la capacidad de colonización radicular. La estimación de la proporción de cada mutante en los inóculos y en rizósfera fue obtenida por amplificación por PCR de regiones de los mini-Tn5 que contienen las firmas y su posterior secuenciamiento (HiSeq-Illumina, >3x108 lecturas totales) y confirmada en microarreglos. A partir de dicha estrategia, y del reciente análisis de sólo una de las mezclas que hemos utilizado, se han podido identificar por STM varios mutantes potencialmente afectados en la colonización radicular, algunos de los cuales ya han sido validados fenotípicamente. Además, algunos mutantes que aun deben ser validados en su fenotipo frente a la cepa salvaje, han sido seleccionados atento a que en los ensayos de STM han mejorado su representación rizosférica (mutaciones con posibles efectos positivos sobre la colonización). Como parte de los ensayos descriptos, hemos incluido tratamientos para investigar la colonización de raíces de alfalfa a diferentes tiempos (3 y 7 días post-inoculación), y la de raíces heterólogas (arveja) para investigar eventuales efectos específicos de colonización. Por otra parte, en ensayos con una configuración similar, hemos realizado un screening por tecnología RIVET de genes inducidos por contacto con la raíz y/o por exudados, hacia la búsqueda e identificación de marcadores y circuitos regulatorios tempranos en los rizobio. La caracterización de los genes obtenidos, su regulación, rol jerárquico en la competencia temprana y en la ocupación final de nódulos, ubicuidad, y especificidad, son herramientas valiosas tanto para la comprensión de la simbiosis en sus aspectos básicos como para el abordaje cierto de la mejora racional y eficiente de rizobios inoculantes.