Evaluación de la competición para la nodulación

LÓPEZ GARCÍA, S.L.; LODEIRO, A.R

Córdoba

Jornada; XV Jornadas Argentinas de Microbiología (JAM 2014); 2014

Asociación Argentina de Microbiología (AAM)

Para evaluar un inoculante es importante conocer, además del número de bacterias viables y su capacidad para nodular, la competitividad intrínseca de la cepa utilizada. Entendemos por competitividad intrínseca a la capacidad de dicha cepa para ocupar nódulos en presencia de una cepa de referencia, en un ensayo de nodulación donde todas las otras variables que pueden condicionarla se mantienen en el óptimo. En este resumen describiremos la metodología para evaluar la competitividad intrínseca de Bradyrhizobium japonicum, aunque la misma puede ser aplicada con ligeras modificaciones a cualquier simbiosis rizobio-leguminosa. Para determinar con facilidad si un nódulo está ocupado por la cepa problema o por la cepa de referencia recomendamos utilizar una resistente a antibióticos como cepa de referencia; en este caso, B. japonicum LP 3018, derivada resistente a estreptomicina y espectinomicina de E109 y con igual competitividad intrínseca. Las bacterias se cultivan en medio rico hasta fase exponencial y previo a la inoculación se registra la DO a 500-600 nm y el número de células totales por recuento al microscopio óptico. Una vez conocidas las concentraciones bacterianas, se realizan diluciones en solución de cultivo de plantas libre de nitrógeno (SCPLN) para obtener cada cepa en un recipiente separado con la misma concentración bacteriana. Al momento de la inoculación deben sembrarse placas para el recuento de UFC. Las plantas pueden cultivarse en vasos de plástico descartables desinfectados llenados con vermiculita estéril, cada uno regado con un exceso de SCPLN conteniendo un millón de bacterias por ml de cada cepa. La siembra de semillas de soja germinadas en forma axénica se realiza inmediatamente después con al menos 15 plantas por competición. Se incluyen macetas inoculadas con SCPLN sin bacterias y con cada cepa en forma separada. Las plantas se cultivan en invernáculo en condiciones óptimas de luz, temperatura y riego al menos hasta que el segundo trifolio esté completamente expandido. Cada nódulo es extraído y colocado en una fosa de placas multipocillo estériles (de 96 pocillos con fondo cónico). Se lo esteriliza superficialmente y se lo macera con un palillo estéril de punta trunca. Este material se deposita en placas de Petri réplicas con medio rico, una de ellas con los antibióticos selectivos para la cepa de referencia. Un nódulo puede estar ocupado simultáneamente por las dos cepas, lo que se conoce como ?doble ocupación?, la que en general no supera el 10% del total de nódulos. Para evaluar el resultado puede utilizarse una prueba de chi-cuadrado. Los resultados esperados para la hipótesis nula (competitividades intrínsecas iguales) serían: 45% cepa problema : 45% cepa de referencia : 10% doble ocupación. Si no se dispone de antibiótico selectivo para la cepa problema, los resultados esperados serían 45% cepa sensible : 55% cepa resistente. La escala de competitividad intrínseca puede obtenerse con el valor de chi-cuadrado calculado.