Obtención de líneas celulares transgénicas para el estudio genético y la manipulación de baculovirus

HAASE, S (1); LÓPEZ, MG (2); PIDRE, ML (1); FERRELLI, ML (1); SCIOCCO-CAP, AI (3); TABOGA, O (2); ROMANOWSKI, V (1)

Buenos Aires

Congreso; XXXIII Reunión Científica Anual- Sociedad Argentina de Virología; 2013

Sociedad Argentina de Virología - Asociación Argentina de Microbiología

Introducción y objetivos.    La línea celular de lepidópteros Tn5B1-4 (Hi5) es susceptible a la infección por varios baculovirus y, generalmente, proporciona una producción de proteínas recombinantes superior en comparación con otras líneas celulares de insectos. Los títulos de partículas infectivas son determinados en las líneas Sf-21 y Sf-9, ya que las placas producidas por AcMNPV (Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus) se distinguen fácilmente, aunque no ocurre lo mismo con otros baculovirus. Por otra parte, los baculovirus producen cuerpos de oclusión (OB) de una forma característica. Las interacciones específicas entre la proteína de la matriz de los OBs y otros componentes virales que controlan la oclusión de los viriones y la morfología de los OBs aún no se comprenden con claridad. Para abordar este problema se desarrollaron líneas celulares que expresan la poliedrina de dos baculovirus, AcMNPV y AgMNPV (Anticarsia gemmatalis multiple nucleopolyhedrovirus).Materiales y métodos.         Mediante métodos estándar de ingeniería genética se construyeron vectores de expresión derivados del plásmido comercial pIB incluyendo genes reporteros lacZ y egfp y de la poliedrina de AcMNPV y AgMNPV bajo el control del promotor viral muy tardío de poliedrina. Luego de las transfecciones de monocapas de Hi5, se aislaron clones celulares y se caracterizó la expresión de las proteínas heterólogas inducibles por infección. La línea celular que expresa GFP fue sembrada en una placa de 96 pocillos e infectada con diluciones seriadas de un virus de título conocido. Se compararon los títulos de centros de infección y los valores de fluorescencia de eGFP luego de la lisis celular. Por otra parte, las líneas celulares que expresan la poliedrina de AcMNPV y AgMNPV fueron infectadas con virus deficientes en poliedrina y se evaluó la aparición de cuerpos de oclusión. Los cuerpos de oclusión obtenidos se utilizaron luego para infectar larvas susceptibles.        Resultados.Se generaron líneas celulares establemente transformadas con genes de interés bajo un promotor inducible por la infección viral. La línea celular que expresa GFP fue utilizada para establecer un método de titulación semiautomatizado que aprovecha la lectura de la fluorescencia para estimar el número de partículas infectivas. Las líneas celulares que expresan poliedrina de AcMNPV y AgMNPV se utilizaron para evaluar la complementación funcional de estos genes. Los resultados demuestran que la poliedrina de AgMNPV puede empaquetar viriones de AcMNPV y que los cuerpos de oclusión generados son infectivos al ser inoculados por vía oral a larvas suceptibles.            Conclusiones. Se estableció un sistema de titulación rápido y simplificado. Se generaron líneas transgénicas útiles para el análisis de complementación funcional de genes de baculovirus. La generación de OBs en líneas celulares empaquetadoras permite producir baculovirus con capacidad de dispersión autolimitada. http://www.aam.org.ar/vermas-eventos.asp?214