EXPRESIÓN DE LA GLICOPROTEÍNA DE SUPERFICIE (GPC) DEL VIRUS JUNÍN: HERRAMIENTAS PARA EL DIAGNÓSTICO Y TRATAMIENTO DE LA FIEBRE HEMORRÁGICA ARGENTINA.

PIDRE MATÍAS LUIS; HAASE SANTIAGO; FERRELLI MARÍA LETICIA; URE AGUSTÍN ENRIQUE; ROMANOWSKI VÍCTOR

Valle Hermoso, Córdoba

Simposio; XXXII Reunión Científica Anual de la SAV; 2012

Sociedad Argentina de Virología

El virus Junín (JUNV) es el causante de la fiebre hemorrágica argentina (FHA), una enfermedad emergente resultado del contacto del hombre con roedores silvestres durante el desarrollo de la actividad agropecuaria. Se utilizó el sistema de expresión basado en baculovirus y células de insecto con el fin de obtener las proteínas estructurales de JUNV. El objetivo del presente trabajo consiste en la expresión de la glicoproteína de superficie de JUNV (GPC) y su utilización para el desarrollo de ensayos de diagnóstico y para la selección de sueros con altos títulos de anticuerpos específicos para el tratamiento de FHA. El marco de lectura abierto (ORF) de GPC se clonó en el plásmido de transferencia pBacPAK9. El DNA del plásmido construido se co-transfectó con el DNA del bácmido bAcGOZA en células de insecto. La recombinación homóloga resultó en un virus recombinante que incorporó el gen de interés (Ac-GPC). Se utilizaron anticuerpos monoclonales provistos por Sánchez et.al. para confirmar mediante Western Blot la identidad de la proteína recombinante. Del mismo modo, se analizó la reactividad de la proteína recombinante frente a sueros de pacientes infectados con JUNV (provistos por el centro de referencia del INEVH). Por otro lado, se realizaron ensayos de inmunofluorescencia sobre cultivos de células de insecto High Five infectadas con el baculovirus recombinante Ac-GPC con el objetivo de determinar la localización celular de la proteína recombinante en el contexto de la infección baculoviral. Finalmente se realizaron enzimoinmunoensayos (ELISA), utilizando células de insecto infectadas con Ac-GPC como coating, probando la reactividad tanto de anticuerpos monoclonales como de sueros de pacientes infectados. Los ensayos de Western Blot mostraron que la proteína recombinante es reconocida tanto por los anticuerpos monoclonales como por los sueros inmunes. Adicionalmente, por inmunofluorescencia se reveló que la proteína GPC es direccionada a la membrana plasmática en el sistema de expresión de células de insecto. Del mismo modo, se utilizó la técnica de inmunofluorescencia para mostrar la reactividad de diferentes sueros de pacientes obteniéndose los mismos resultados. Los ELISA mostraron nuevamente la reactividad de los anticuerpos ensayados contra la proteína recombinante de un modo dosis dependiente variando las diluciones de anticuerpo primario. Estos ensayos permitieron determinar cuáles sueros contienen altos títulos de anticuerpos específicos contra GPC. Debido a que GPC es la glicoproteína de superficie de JUNV que interacciona con el receptor celular, es esperable que aquellos sueros que contengan altos títulos de anticuerpos contra GPC tengan mayor capacidad neutralizante. En conclusión, el sistema de expresión en células de insecto resultó ser una herramienta eficiente para la expresión de GPC. El direccionamiento de la glicoproteína hacia la membrana plasmática permitió el desarrollo de ensayos de diagnóstico utilizando células enteras exponiendo en su superficie el antígeno viral.