Construcción de herramientas RIVET para el estudio de expresión de genes expresados durante la simbiosis Sinorhizobium meliloti-alfalfa

SALAS, MARÍA EUGENIA; LOZANO, MAURICIO JAVIER; MARTINI, CARLA; LÓPEZ, JOSÉ LUIS; SALTO, ILEANA; TORRES TEJERIZO, GONZALO; GIUSTI, MARÍA DE LOS ÁNGELES; DEL PAPA, FLORENCIA; PISTORIO, MARIANO; LAGARES, ANTONIO

Piriápolis

Congreso; RELAR (reunión latinoamericana de rhizobiología); 2011

El cultivo de alfalfa resulta de particular importancia en países ganaderos por ser la principal fuente forrajera que alimenta al ganado vacuno. En ese contexto, el mejoramiento racional de la simbiosis de alfalfa con rizobios eficientes debe ir acompañado de una caracterización detallada a nivel molecular del proceso de asociación, y de la influencia del entorno sobre el mismo. Lamentablemente, las técnicas de estudio de expresión de genes mayormente utilizadas, tales como micro y macro arrays, resultan en muchos casos limitadas cuando se desea caracterizar etapas de la simbiosis que son de difícil acceso ó donde el material de interés es escaso (ej. hilos de infección, nichos del interior del nódulo). Con el propósito de desarrollar nuevas técnicas para el estudio de la simbiosis, en nuestro laboratorio hemos trabajado en la construcción de herramientas RIVET (Recombination-based In Vivo Expression Technology) para su aplicación en el sistema S. meliloti-alfalfa. Estas técnicas se basan en la utilización del gen sin promotor tnpR que codifica una recombinasa especifica de sitio, para realizar fusiones transcripcionales a lo largo de todo el genoma de S. meliloti. La expresión de la recombinasa a partir de promotores del rizobio y la pérdida subsiguiente de un cassette indicador de DNA, permite luego la selección fenotípica de aquellos clones que expresan genes que sólo se encienden en nichos de interés (ej. a lo largo de la simbiosis).  En este trabajo hemos construido una nueva herramienta RIVET basada en el uso de un transposón derivado del Tn5 para generar las fusiones transcripcionales a tnpR. Este nuevo transposón, que se encuentra en un plásmido suicida en rizobios, posee en uno de sus extremos un fragmento que consta de las 19bp necesarias para la unión de la transposasa y que sustituye la IS50L. En el otro extremo hemos preservado la IS50R intacta. Rio abajo del extremo izquierdo, y seguido de señales terminadoras de la traducción, hemos clonado el gen tnpR sin promotor, un gen que codifica resistencia a tetraciclina, y el origen de transferencia conjugativa oriT del plásmido RP4. La nueva herramienta será utilizada para la construcción de fusiones transcripcionales a tnpR en S. meliloti y podrá ser empleada para la generación de bibliotecas RIVET en otros rizobios y bacterias de interés sin la necesidad de generar bibliotecas plasmídicas.