IBBM   21076
INSTITUTO DE BIOTECNOLOGIA Y BIOLOGIA MOLECULAR
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
DIAGNOSTICO MOLECULAR PARA COQUELUCHE EMPLEANDO UNA PLATAFORMA MULTIPLEX DE PCR EN TIEMPO REAL
Autor/es:
FLORES, DARIO; LARA, CLAUDIA; BOTTERO, DANIELA; FIORI, SILVANA; SORHOUET, C; RUGGERI, D; ZURITA, MARIA EUGENIA; GALAS, MARCELO; HOZBOR, DANIELA
Reunión:
Congreso; III CONGRESO NACIONAL DE REDES XV REUNION ANUAL DE REDES DE LABORATORIO; 2011
Resumen:
Introducción:Coqueluche o tos convulsa es una enfermedad respiratoria altamente contagiosa que afecta tanto a niños como a adolescentes y adultos. Los síntomas y signos característicos de la enfermedad son la tos, tos paroxística, vómito postusivo, apneas y cianosis. Las manifestaciones más graves ocurren en los niños menores de 6 meses de edad no inmunizados pudiéndoles ocasionar incluso la muerte. En adolescentes y adultos, la enfermedad se presenta con un cuadro clínico mas leve y en ocasiones puede manifestarse como una tos persistente durante largos periodos de tiempo lo cual favorece la trasmisión del patógeno hacia la población mas susceptible.El principal agente etiológico de la enfermedad es Bordetella pertussis aunque otras especies del género como B. parapertussis e incluso B. bronchiseptica pueden ocasionar una enfermedad con sintomatología similar a pertussis. Recientemente se ha identificado a B. holmesii en pacientes con cuadros respiratorios agudos.El diagnostico de esta patología en el laboratorio se puede realizar mediante diferentes metodologías las cuales requieren como muestra clínica sueros o secreciones nasofaríngeas. Estas metodologías son:1- Serológica que evalúa títulos de anticuerpos totales anti Bordetella a través de un ensayo de ELISA. La plataforma hasta ahora empleada requiere de 2 muestras de sueros tomados con diferencia de 21 días (correspondientes a fase aguda y fase convaleciente respectivamente).2- Microbiológica, que consiste en el aislamiento del agente causal en medios específicos. El diagnóstico microbiológico aunque de baja sensibilidad es el gold standard.3- Molecular, que detecta específicamente mediante ensayos basados en PCR la presencia en el paciente de ADN del agente causal. Los ensayos de PCR pueden realizarse en formato convencional o en tiempo real.Mediante estas metodologías el Laboratorio Nacional de Referencia para Coqueluche de nuestro país (IBBM FCE – UNLP - INEI ANLIS – Malbrán) contribuye a la detección del aumento sostenido de casos que viene registrando el Ministerio de Salud de La Nación desde el año 2002.El objetivo de este trabajo consistió en evaluar la capacidad diagnóstica de la PCR en tiempo real en forma comparativa con la PCR convencional y en el contexto clínico epidemiológico del paciente.Materiales y Métodos:Durante el período septiembre del 2010 – marzo del 2011, 89 muestras provenientes de pacientes con sospecha clínica de coqueluche fueron analizadas mediante ensayos de PCR convencional y PCR en tiempo real. El algoritmo seguido para el diagnóstico molecular se presenta en la Figura 1. Los ensayos de PCR convencional incluyen tres sets de primers, dos para las secuencia de inserción IS481 e IS1001 y un tercero para el promotor de la toxina pertussis (PT). Estos primers permiten identificar secuencias de ADN propias de B. pertussis, B. parapertussis y Bordetella spp (Tabla 1 A).Para los ensayos de PCR en tiempo real se emplea una plataforma multiplex la cual permite identificar además de B. pertussis y B. parapertussis a B. holmesii (Tabla 1 A).Luego y en base a los resultados que se obtengan y teniendo en cuenta los datos clínicos epidemiológicos del paciente se realizará la clasificación y cierre del caso.Resultados:De las 89 muestras obtenidas de pacientes con diagnóstico clínico de coqueluche y analizadas en forma comparativa mediante los dos ensayos de PCR (convencional y en tiempo real), 12 tuvieron un resultado positivo en la PCR en tiempo real y las restantes 77 repitieron el resultado negativo obtenido con la PCR convencional.De estas 12 muestras, 8 tuvieron un resultado negativo en la PCR convencional que emplea tanto los primers de las secuencias IS481 como con los de IS1001 y 4 tuvieron un resultado positivo en la PCR convencional que emplea primers específicos de la secuencia de inserción IS481. De estas 4 muestras, 2 se correspondieron a B. pertussis y 2 a B. holmesii en los ensayos de PCR en tiempo real.La totalidad de los pacientes con resultados positivos en el diagnóstico molecular eran menores de un año de edad que presentaban al menos dos síntomas característicos de la enfermedad y con esquema de vacunación completo en el 70% de los pacientes. De las 12 muestras con resultado positivo en PCR en tiempo real, 10 fueron compatibles con ADN específico de B. pertussis, amplificando las secuencias IS481 y PtxS1 y 2 de B. holmesii, amplificando las secuencias IS481 e IS1001h.Conclusiones: Estos resultados muestran a la PCR en tiempo real con una mayor capacidad diagnóstica para coqueluche que la PCR convencional. Sin embargo es de destacar que la PCR convencional en el algoritmo seguido por los laboratorios asociados a la red representa una herramienta efectiva para el diagnostico oportuno de la enfermedad. La aplicación de la nueva tecnología cobra mayor relevancia al brindar la posibilidad de identificar diferentes especies de Bordetella en un único ensayo multiplex.