Aislamiento y caracterización de un mutante sensible a la acidez de Rhizobium sp. LPU83

MARTINI, C; SALTO, I. P.; SALAS, M, E.; TORRES TEJERIZO, G. A.; GIUSTI, M. A.; LOZANO, M. J.; PISTORIO, M.; LAGARES, A.; DEL PAPA, M.F.

Buenos Aires

Congreso; XII Congreso Argentino de Microbiologia.; 2010

Asociación Argentina de Microbiología.

Introducción. La simbiosis Medicago sativa (alfalfa)-rizobio es en general muy específica, siendo el simbionte natural de esta planta Sinorhizobium meliloti. Sin embargo, se han caracterizado otros rizobios capaces de nodular alfalfa; entre ellos la cepa LPU83, aislada en suelos de Argentina, y estrechamente emparentada con la cepa Or191, aislada previamente en Oregón, Estados Unidos. En particular, estos aislamientos resultaron de gran interés debido a su capacidad para nodular un amplio rango de plantas, su ineficiencia para fijar nitrógeno y su tolerancia a la acidez. Esta última característica convierte a la cepa LPU83 tipo Or191 en una importante herramienta para el estudio de los mecanismos involucrados en la tolerancia a la acidez en rizobios, dado que la acidez de los suelos es uno de los principales factores que limitan crecimiento de la alfalfa cuando el nitrógeno es aportado por microorganismos fijadores. Objetivo. En este trabajo, describimos la generación y caracterización de un mutante sensible a la acidez obtenido a partir de una mutagénesis generalizada por transposición en R. sp. LPU83. Materiales y Métodos. Medios de cultivo: LB (Sambrook et al., 1989), TY (Beringer, 1974) y GS (Del Papa et al., 1999). Las técnicas moleculares se realizaron según Sambrook et al., 1989. Resultados. Para identificar genes asociados con la tolerancia a la acidez, se realizó una mutagénesis generalizada sobre la cepa LPU83 con el transposón Tn5. De los mutantes generados, identificamos uno que se vio disminuido en su capacidad de crecer a pH 5.0. Mediante clonado de la inserción, secuenciamiento y comparación con bases de datos se encontró que dicho mutante contenía interrumpido el extremo carboxilo terminal de un marco de lectura abierto (ORF1) situado río arriba de un gen homólogo a ubiH (codifica para una hidroxilasa interviniente en la biosíntesis de ubiquinona). Considerando el posible carácter polar de la mutación, se construyeron dos mutantes sitio específico para los genes ORF1 y ubiH. Ambos mutantes desarrollaron en medio mínimo en condiciones ácidas una menor velocidad específica de crecimiento. También presentaron una competitividad para la nodulación nula frente a la cepa salvaje LPU83, tanto en M. sativa como en P. vulgaris. Además, en los dos mutantes observamos una tolerancia disminuida a la presencia de ascorbato (condiciones reductoras) y a concentraciones elevadas de Zn2+. Conclusiones. Los resultados que hemos obtenido muestran que el gen ubiH participa en la tolerancia de las cepas tipo R. sp. LPU83 a la acidez y a otros estreses. Asimismo, alteraciones en el mismo gen mostraron dis minuir muy fuertemente la competitividad de los rizobios para la nodulación de M. sativa y P. vulgaris.