IGEVET   21075
INSTITUTO DE GENETICA VETERINARIA "ING. FERNANDO NOEL DULOUT"
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Expresión de la proteína N del virus de la Arteritis Equina y evaluación de su reactividad frente a sueros equinos por western blotting
Autor/es:
GAMBARO S; METZ GE; SERENA M; GONZÁLEZ ET; MÓRTOLA EC; ECHEVERRÍA MARÍA
Lugar:
Villa Giardino, Córdoba
Reunión:
Jornada; XXX Reunión Anual de la Sociedad Argentina de Virología; 2010
Institución organizadora:
Sociedad Argentina de Virología
Resumen:
Introducción:El virus de la Arteritis Equina (VAE) produce una enfermedad que afecta exclusivamente a los miembros de la familia Equidae. La mayoría de las infecciones adquiridas naturalmente con el VAE son subclínicas, en caso de manifestarse la enfermedad, se pueden evidenciar signos como fiebre, edema, conjuntivitis, aborto, enfermedades respiratorias en animales adultos y neumonía en potrillos. Este virus se lo incluye dentro de la familia Arteriviridae, orden Nidovirales. El ORF7 codifica para la proteína de la nucleocápside (N, 14KDa) es muy conservada y representa 35-40% de las proteínas totales del virión. La respuesta humoral de los equinos está dirigida principalmente contra esta proteína y las codificadas por los ORF5 y 6 (GP5 y M).Objetivo: El presente trabajo propone clonar, expresar y purificar la proteína N del VAE en un sistema de expresión bacteriano, con el fin de obtenerla como antígeno y evaluar su reactividad frente a sueros equinos mediante western blotting.Materiales y Métodos:Se diseñaron primers específicos con sitios de corte y junto con el cDNA de la cepa LP02/C como molde, se obtuvo el gen que codifica la proteína de interés. Se clonó en el vector pGEM-T y se transformaron bacterias E. coli Top10 competentes. Luego por medio de las enzimas de restricción presentes en los cebadores, se digirió al pGEM-T. El inserto de interés se ligó al vector pQE30. Este vector permite la expresión de proteínas por medio de un promotor inducible por IPTG y a su vez adiciona en el N- terminal una cola de histidinas a la proteína de interés. Se transformaron bacterias E. coli M15 y BL21 pREP competentes y se evaluó la expresión de la proteína recombinante por medio de la inducción. Se purificó la proteína utilizando una columna de agarosa Ni-NTA. Se evidenció la purificación por geles de acrilamida, y se evaluó por inmunoblotting la reactividad de los sueros equinos. Resultados: A partir de las bacterias recombinantes E. coli M15 y BL21 pREP pQE30-N inducidas, se expresó la proteína de interés, corroborado por medio de la secuenciación. Se purificó la proteína N, y se evidenció por geles de acrilamida. Mediante western blotting se evaluó la reactividad de 14 sueros equinos, 4 de referencia y 10 del banco de sueros de la Cátedra de Virología de la Universidad Nacional de La Plata, previamente caracterizados como positivos o negativos por virus neutralización. A partir de la dilución 1/400 se pudo discriminar entre sueros positivos y negativos perfectamente. Conclusiones:Se logró con éxito clonar y expresar la proteína N de VAE en el vector de expresión pQE30 en E. coli M15 y Bl21 pREP. Se purificó la proteína a partir de una columna de agarosa Ni-NTA. Los sueros equinos positivos reconocieron a la proteína N específicamente.