Validación de 11 técnicas de PCR en tiempo real para la rápida detección de bacterias patógenas causantes de diarrea infantil

GALLI LUCÍA; GOLIJOW C; LEOTTA GA; LONDERO A; COSTA M; GONZALEZ E; BRUSA V.; GUTKIND G

Rosario

Congreso; XXIII Congreso Latinoamericano de Microbiología; 2016

Asociación Argentina de Microbiología

Las diarreas bacterianas ocasionan morbilidad y mortalidad en todo el mundo, particularmente en países en desarrollo. Los métodos convencionales de aislamiento de estas bacterias continúan siendo la forma de diagnóstico más utilizada en los laboratorios clínicos, aun cuando su tiempo de procesamiento atenta contra el establecimiento de estrategias de soporte (paciente) y de control (diseminación). El objetivo de este trabajo fue validar 11 reacciones de PCR en tiempo real para la rápida detección de 10 bacterias patógenas causantes de diarrea infantil.Se evaluaron primers para la detección de genes específicos de Salmonella spp. (ttR), Shigella spp. (ipaH), E. coli enteropatogénico (eae), E. coli enterotoxigénico (eltA), E. coli productor de toxina Shiga (stx1 y stx2), E. coli O157:H7 (wzxO157), Cronobacter sakazakii (ompA), Campylobacter termotolerante (cadF), Vibrio cholerae (toxR) y Clostridium difficile (tcdB) mediante PCR en tiempo real utilizando sondas TaqMan. Para cada PCR se determinaron los siguientes parámetros utilizando cultivos bacterianos puros: a) Rango de trabajo (límite de detección y límite de corte) con 1 cepa en concentaciones de 10 a 105 UFC/reacción, b) Inclusividad con 10 cepas positivas en la concentración correspondiente al límite de corte, c) Exclusividad con 9 cepas negativas en concentración 106 UFC/reacción y d) Robustez con 5 cepas positivas y 5 cepas negativas en concentración 106 UFC/reacción, modificándose las siguientes variables: día de ensayo, equipo y lugar de realización del ensayo. Se empleó el termociclador ABI StepOne Plus de Applied Biosystems. El volumen final de la mezcla de reacción fue de 25 µL conteniendo: 12,5 µL de master mix PB-L (Productos Bio-Lógicos, Argentina), 0,4 µM de cada primer, 0,2 µM de cada sonda marcadas con el fluoróforo FAM y 5 µL del extracto de ADN. El perfil térmico utilizado fue el siguiente: desnaturalización a 95°C por 10 min, 40 ciclos de amplificación a 95°C por 15 seg y a 59°C por 1 min. El límite de detección fue, para todas las reacciones, menor a 100 UFC/reacción y el límite de corte fue 100 o 1000 UFC/reacción según el gen target. La inclusividad fue de 100% para todas las reacciones excepto aquellas para Campylobacter y Clostridium que detectaron el 90% de las cepas y para Cronobacter cuya detección fue del 80% de las cepas. La exclusividad fue del 100% en todos los casos y la robustez fue óptima al modificar las diferentes variables mencionadas anteriormente. Es necesario realizar una validación con muestras de materia fecal contaminadas experimentalmente.Las PCR validadas son una alternativa rápida y sensible para la detección de 10 bacterias patógenas, cuya aplicación podría contribuir a disminuir el tiempo de diagnóstico clínico de diarreas bacterianas y mejorar la vigilancia epidemiológica.