Desarrollo y evaluación de dos PCR-RT para la detección de genes stx en carne picada.

BRUSA V.; LIRON J.P.; ALIVERTI F.; ALIVERTI V.; BROCARDO S.; LEOTTA G.A.

Ciudad Autónoma de Buenos Aires

Congreso; I CONGRESO INTERNACIONAL DE ZOONOSIS Y ENFERMEDADES EMERGENTES Y VII CONGRESO ARGENTINO DE ZOONOSIS.; 2011

Asociación Argentina de Zoonosis

Escherichia coli productor de toxina Shiga (STEC) es un patógeno emergente asociado a enfermedades transmitidas por alimentos. El ganado vacuno es su principal reservorio y la carne picada cruda o insuficientemente cocida es una de las fuentes de infección más frecuente para el hombre. Las toxinas Shiga constituyen el principal factor de virulencia de STEC y se encuentran codificadas por los genes stx. El objetivo del trabajo consistió en desarrollar y evaluar una técnica de PCR-TR para el tamizaje de STEC a partir de carne picada. Se diseñaron dos técnicas de PCR-TR para la detección de los genes stx1 y stx2, utilizando SYBR Green. Se determinó la inclusividad y exclusividad de ambas técnicas con 53 cepas de STEC y 30 cepas no-STEC. Posteriormente, las técnicas diseñadas se desafiaron con 54 muestras obtenidas a nivel de boca de expendio. A 25 g de carne picada se le adicionaron 225 ml de caldo EC, incubándose a 42ºC por 18-20 h. La extracción de ADN se realizó por ebullición en buffer tritón. A partir de este extracto se realizaron las técnicas de PCR diseñadas y la técnica de PCR-MK. El aislamiento se realizó en agar Mac Conkey y EMB Levine. A partir de la confluencia del agar Mac Conkey se realizó la técnica de PCR múltiple. De las placas positivas se realizaron pooles de colonias para obtener un aislamiento. Los resultados obtenidos con las técnicas de PCR-RT y PCR-MK fueron contrastados con los resultados obtenidos con la PCR múltiple y el aislamiento. Un total de 17 (31,5%) muestras positivas no fueron detectadas mediante la técnica de PCR-MK. La inclusividad y exclusividad de las PCR-TR fue del 100% cuando se utilizaron cepas de colección. Al analizar muestras de campo se obtuvo 100% de inclusividad, 50% (IC 32,1-67,9) de exclusividad, 61,5% (IC 46,3-76,8) de valor predictivo positivo y 100% de valor predictivo negativo. Al analizar las mismas muestras con la PCR-MK se obtuvo 58,5% (IC 43,4-73,6) de inclusividad, 100% de exclusividad, 100% de valor predictivo positivo y 43,3% (IC 25,6-61,0) de valor predictivo negativo. Con las técnicas de PCR-TR fue posible detectar todas las muestras STEC-negativas, asegurando la ausencia de estos microorganismos en las muestras. Sin embargo, no concuerdan los resultados de inclusividad obtenidos con cepas de colección y muestras a campo. Esta falta de coincidencia puede deberse a problemas asociados con la metodología de aislamiento, al alto límite de detección de la PCR múltiple o bien a falsos resultados positivos de las PCR-TR. Para mejorar la detección de STEC a partir de carne picada se propone modificar la metodología de aislamiento y reducir los posibles resultados falsos positivos de las PCR-TR mediante la utilización de sondas.