Estudio de la translocación de nNOS a la mitocondria en modelos de transcripción in vitro y en cultivos celulares.

MOLINAS MF, FRANCO MC, GOZÁLEZ AS, PODEROSO JJ, CARRERAS MC.

Mar del Plata, Argentina

Congreso; LII Reunión Científica Sociedad Argentina de Investigación Clínica.; 2007

Sociedad Argentina de Investigación Clínica.

El óxido nítrico sintetizado en la mitocondria por la óxido nítrico sintasa mitocondrial (mtNOS), regula el consumo de oxígeno por inhibición reversible de citocromo oxidasa. mtNOS ha sido descripta como la isoforma alfa de NOS neuronal (nNOS) y se encuentra asociada a la membrana interna mitocondrial. nNOS posee un dominio pdz en su extremo N-ter por el cual interacciona con otras proteínas, lo que determina su ubicación subcelular. Con el objeto de estudiar la translocación de nNOS a mitocondria realizamos ensayos con un sistema de transcripción-traducción in vitro (STT), utilizando un vector que codifica para nNOS con un tag V5 en el extremo C-ter, bajo un promotor T7 y transfectamos células HEK293, que no expresan ninguna de las isoformas de NOS, con un vector que codifica para nNOS con un tag HA en el extremo C-ter, bajo un promotor CMV. En los ensayos in vitro, las mitocondrias de células HEK fueron incubadas con nNOS sintetizada por el STT y luego una alícuota fue tratada con proteinasa K (PK), para eliminar las proteínas asociadas a la cara citosólica de la membrana externa. nNOS se encontró asociada a mitocondrias y la proteína de 160 kD fue parcialmente resistente al tratamiento con PK, perdiendo los extremos amino y carboxilo terminal, quedando protegido un fragmento de 130 kD luego del tratamiento (determinado por western blot utilizando anticuerpos anti-tag y anti-N-ter, C-ter y secuencia interna de nNOS). En células HEK 293 transfectadas por 24 hs. con el vector de expresión de nNOS, se obtuvieron resultados similares. La expresión en el STT de una construcción que codifica para nNOS sin el dominio pdz, mostró que esta proteína conserva la capacidad de asociarse a la membrana externa mitocondrial. Conclusiones: a) la entrada de nNOS a la mitocondria ocurre por reconocimiento de secuencias internas de la proteína por parte de la maquinaria de translocación; b) La asociación de nNOS a la membrana externa mitocondrial es independiente de su dominio pdz.