117) Caracterización de la deleción del transportador 1 de glicina en neuronas prosencefálicas en procesos de memoria y atención.

SERRANO, L ; DUBROQUA, S ; GARGIULO, PA ; FELDON, J ; BOISSON, D ; YEE, BK

Mendoza

Jornada; XI Jornadas de Investigación 2010. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo.; 2010

Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo.

117) 2010. Serrano, L ; Dubroqua, S ; Gargiulo, PA ; Feldon, J ; Boisson, D ; Yee, BK Caracterización de la deleción del transportador 1 de glicina en neuronas prosencefálicas en procesos de memoria y atención. XI Jornadas de Investigación 2010. Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Cuyo. http://fcm.uncu.edu.ar/jornadas2010/index.php/articulos/view/35   Caracterización de la deleción del transportador 1 de glicina en neuronas prosencefálicas en procesos de memoria y atención. Serrano, L ; Dubroqua, S ; Gargiulo, PA ; Feldon, J ; Boisson, D ; Yee, BK Laboratorio de Neurociencias y Psicología Experimental, Área de Farmacología, Facultad de Ciencias Médicas. UNCuyo. Mendoza, Argentina. Laboratorio de Neurobiología Comportamental, Instituto Federal Suizo de Tecnología (ETH), Zurich, Suiza. INTRODUCCIÓN Pensamientos tempranos han enfatizado que los síntomas psicóticos son el resultado de una hiperactividad de los sistemas dopaminérgicos mesocorticolímbicos, sin embargo durante las últimas dos décadas se ha sugerido que este estado de hiperdopamnergia constituye una alteración secundaria a una hipofunción glutamatérgica mediada por receptores NMDA, la cual sería asimismo responsable de los síntomas negativos y las disrupciones cognitivas asociadas a esquizofrenia. Es así que el desarrollo de nuevas y más eficaces drogas antipsicóticas se ha concentrado en estrategias dirigidas a incrementar la función del NMDA. La glicina actúa como un co-agonista obligatorio del receptor NMDA y la elevación de este neurotransmisor en la hendidura sináptica permite activar e incrementar la función del este receptor. Una forma de lograr este incremento de glicina consiste en el bloqueo del transportador 1 de glicina (GlyT1), el cual co-localiza con los receptores NMDA y su función es recaptar la glicina de la hendidura sináptica. La hipótesis que plantea el efecto pro-cognitivo y antipsicótico de la inhibición del GlyT1 es sustentada con importante evidencia a partir del antagonismo farmacológico del GlyT1 y a través del desarrollo de líneas de ratones transgénicos con deficiencia de GlyT1. El presente estudio constituye una continuación de la caracterización de ratones deficientes en GlyT1 neuronal en procesos de memoria y atención. Determinando como blanco las  neuronas prosencefálicas, esta manipulación molecular provee un modelo altamente específico con el cual probar la hipótesis de la influencia del GlyT1 en la interacción entre glicina y el receptor NMDA. Esto es relevante en torno a la distinción entre las poblaciones de GlyT1 neuronales y astrocitarias, dado que las primeras se encuentran únicamente asociadas a receptores NMDA, mientras que las últimas involucran asimismo la regulación de sinapsis glicinérgicas inhibitorias. Es necesario por lo tanto distinguir sus respectivas significancias funcionales en el control de funciones cerebrales superiores, con el objetivo de orientar la correcta dirección que deberá tomar el desarrollo de inhibidores de GlyT1 con propósitos terapéuticos. MATERIALES & MÉTODOS Dos cohortes independientes de ratones CamKIIaCre:Glyt1tm1.2fl/fL (mutantes) y sus congéneres GlyT1tm1.2fl/fl (controles) fueron utilizadas. La primera de 7 machos mutantes y 7 machos controles fue evaluada en los experimentos de Y-maze y cheesboard (Dry-maze). La segunda cohorte, compuesta de 20 mutantes (10 machos + 10 hembras) y 20 controles (10 machos + 10 hembras) fue evaluada en un test atencional conducido en cajas operantes. Los protocolos experimentales son sintetizados en la Figura 1. RESULTADOS Experimento 1: El laberinto en Y (Y-maze) para evaluación de familiaridad espacial no fue afectado por la deleción de GlyT1 neuronal en prosencéfalo. La exploración preferencial del brazo nuevo comparada con los otros dos brazos familiarizados en la primera fase del experimento es tomada como medida de reconocimiento espacial o juicio de familiaridad (Figura 2). Este efecto fue evidente a través de todos los intervalos implementados (2 min, 2 h y 24 h), a pesar de que fue disminuyendo a medida que el intervalo entre fases aumentó, lo cual era esperable. Sin embargo, no hubo diferencia significativa en el rendimiento entre el grupo mutante respecto del control. El análisis ANOVA (Genotipo x Brazos) reveló un significativo efecto de brazos para el intervalo de 2 minutos [Distancia cubierta por brazo: F(2, 20)=19.840; p<.001; Transformación logarítmica del tiempo transcurrido en cada brazo: F(2, 20)=8.274; p<.005; y números de entradas a cada brazo: F(2, 20)= 9.110; p<.005], de 2 horas [tiempo transcurrido en cada brazo: F(2, 20)= 3.921; p<.05; distancia cubierta por brazo: F(2, 20)= 5.668; p<.05], y de 24 horas [tiempo transcurrido en cada brazo: F(2, 20)= 4.875; p<.05; distancia cubierta por brazo: F(2, 20)= 4.688; p<.05]. No hubo evidencia de interacción debida a genotipo. Experimento 2: La búsqueda espacial en el laberinto seco (Dry-maze) no fue afectada por la deleción de GlyT1 neuronal en prosencéfalo. Memoria referencial espacial Los animales buscaron la comida escondida en el laberinto seco en una localización fija a través de los días. La memoria referencial fue reflejada por la reducción en el tiempo transcurrido y distancia recorrida hasta encontrar el agujero recompensado a través de los días [Tiempo: (8, 96)=7.817; p<.001; Distancia:F(8, 96)=9.064; p<.001] en ANOVA (Genotipo x Días). Sin embargo, el desempeño no difirió entre mutantes y controles (Figura 3). Aprendizaje reverso La recompensa ahora fue relocalizada en una nueva posición dentro del laberinto seco. Los animales rápidamente se adaptaron al cambio y el desempeño permaneció relativamente estable a lo largo de 6 días (Figura 3). Memoria de trabajo espacial Luego, el laberinto fue trasladado a una nueva habitación con nuevas claves espaciales y la memoria de trabajo fue evaluada. No fue detectado un aprendizaje diario ni en mutantes ni en controles. (Figura 3). Esta igual performance se mantuvo inclusive al realizar dos variaciones de la prueba, las cuales consistieron en realizar cuatro trials dentro de un día, así como efectuar dos trials diarios pero con el cambio de localización del agujero recompensado cada dos días. El objetivo de esta última variante era evaluar en qué magnitud la memoria de trabajo podría ser potenciada por información adquirida previamente. Experimento 3: Prueba de tiempo de respuesta serial ante dos opciones (Figura 4). En las cajas operantes, los animales aprendieron a presionar una palanca y dirigirse a la ventana correcta para obtener su recompensa. Inmediatamente luego de haber sido presionada la palanca, la ventana correcta era marcada por un breve estímulo de luz dentro de ella, cuya duración era de 0.1, 0.3, 0.5 o 1segundo. Las experiencias con drogas fueron contrabalanceadas entre pruebas. • Fase 1: Atención sostenida bajo condiciones normales. Como era esperable, se evidenció una reducción en la exactitud de selección de la ventana correcta conforme se reducía el tiempo durante el cual esta permanecía iluminada. El porcentaje de trials omitidos se incrementó con la reducción del tiempo de iluminación  [F(3, 102)=9.387; p<.001], mientras que el porcentaje de trials correctos se redujo significativamente [F(3, 102)=48.933; p<.001]. El primer parámetro fue utilizado para evaluar la capacidad de captura de la señal, mientras que el segundo la habilidad para discriminar la localización de la misma. El análisis ANOVA (Genotipo x Sexo x Duración de señal) demostró que la capacidad atencional fue similar en ambos grupos. • Fase 2: Efecto del antagonismo muscarínico en atención. Si bien la dosis de 0.5 mg/kg no modificó el desempeño del grupo tratado, una dosis de  1 mg/kg produjo una mayor afectación en la exactitud de selección de la ventana correcta [F(3, 96)=4.889; p<.005] en un ANOVA que comparó Genotipo x Droga x Duración de señal. El efecto producido por la droga fue similar tanto en el grupo mutante como en el control y si bien el efecto de la droga fue más pronunciado en la duración más corta, esto es atribuible al efecto base de la condición de menor duración de estímulo. • Fase 3: Efecto del antagonismo NMDA en atención. El efecto de MK-801 (0.5mg/kg) no afectó el desempeño ni indujo una diferencia significativa entre controles y mutantes. La exactitud [F(3, 96)=82.209; p<.001] y omisiones [F(3,96)=3.588; p<.05] permanecieron altamente sensibles a la duración de la señal. CONCLUSIONES El presente estudio no ha podido demostrar evidencia pro-cognitiva en ratones con deleción selectiva del GlyT1 de neuronas prosencefálicas. Este resultado contrasta con previos reportes de incremento del condicionamiento clásico, memoria de objetos y memoria de localización de objetos en estos ratones. Los experimentos en Y-maze sugieren que la familiaridad espacial no fue incrementada. Previos resultados en water maze no revelaron efectos significativos en esta línea de ratones. Si bien water maze no es una prueba ideal en estos animales, los presentes experimentos en una versión seca del mismo paradigma tampoco revelaron efectos de genotipo. No se han podido replicar los hallazgos previos de un aumento en la memoria de reversión demostrada por un menor efecto de reversión de la prueba sobre el aprendizaje. Similarmente, las capacidades de memoria de trabajo continúan siendo poco caras debido a que no hemos podido demostrar un correcto desempeño en esta función ni en mutantes ni en controles. Finalmente, los grupos mutante y el control fueron indistinguibles respecto pruebas atencionales incluyendo la sensibilidad a escopolamina. En síntesis, no hubo evidencia acerca de qué manera las diversas funciones cognitivas implicadas en esta colección de pruebas efectuadas son modificadas en la deleción selectiva del GlyT1 en neuronas prosencefálicas. Consecuentemente, se pone en duda la generalidad de hallazgos previos así como la postulación de la inhibición del GlyT1 como un medio para incrementar funciones cognitivas debido a su impacto anticipado sobre el mecanismo neuronal-dependiente del receptor NMDA. Imagen 1 Imagen 2 Imagen 3 Imagen 4