Producción de la nucleoproteína (NP) del virus de la gripe mediante el sistema de baculovirus recombinante

CARGNELUTTI, D; ALVAREZ, P; BOADO, L; SANCHEZ, V; MATTION, N; SCODELLER, E

Buenos Aires

Congreso; IX Congreso Argentino de Virología. Septiembre 22-25, 2008; 2008

Sociedad Argentina de Virología

El virus de la gripe es un patógeno respiratorio que produce altos índices de morbilidad y mortalidad. La gran mayoría de las vacunas trivalentes actualmente en uso contienen las proteínas de la envoltura viral obtenidas a partir de virus purificado que se producen en huevos de gallina. Esta vacuna induce principalmente anticuerpos contra la hemaglutinina viral capaces de proteger individuos vacunados de la infección viral. Cambios en la antigenicidad de las glicoproteínas virales limita la efectividad de los programas actuales de vacunación. Se ha demostrado que gran parte de la respuesta inmune celular inducida por una infección viral esta dirigida contra la nucleoproteína viral (NP) y la proteína de matriz (M). La estructura antigénica de estas proteínas es mucho más conservada que la de las glicoproteínas de envoltura. Se sabe que inmunización con la NP viral es capaz de inducir protección contra la descarga de virus infectivos homólogos y heterólogos. Aunque la inmunidad celular no es capaz por si sola de controlar la infección, contribuye significativamente a restringir la diseminación y ayuda a eliminar el virus del organismo. Un estudio reciente en humanos sugiere que la respuesta a células T representa un mejor correlato de protección en ancianos que el título de anticuerpos, lo que enfatiza la importancia de este tipo de inmunidad. En concordancia con esto se decidió encarar la producción de la NP recombinante del virus de la gripe mediante el sistema de baculovirus. DESARROLLO: Se utilizó una cepa de Influenza A/Nueva Caledonia. El virus fue purificado a partir de líquido alantoideo de huevos infectados. Se amplifica el segmento 5 (codificante de la NP ) por la técnica de RT-PCR utilizando primers específicos. El gen de la NP fue transferido al vector pFastBack (Invitrogen), generando el plásmido pFastaBack-NP. Con este último se transforman células E.coli DH10bac (conteniendo bácmido con la totalidad del genoma de AcNPV) permitiendo que tenga lugar una recombinación entre el vector de transferencia (pFastBack-NP) y el bácmido residente en las DH10bac. Dicho evento genera un bácmido conteniendo el transgen ( NP) bajo el promotor de la Polihedrina de AcNPV. Las bacterias donde dicho evento tuvo lugar son seleccionadas mediante el uso de los antibióticos correspondientes y se purifica el DNA del bácmido conteniendo el gen de la NP. Con dicho bácmido se transfectan células de Spodoptera frugiperda (Sf9). Luego de 5 días se visualiza efecto citopático inducido por la generación de una nueva cepa recombinante de AcNPV conteniendo el gen de la NP, que denominamos AcNPV-NP. A partir del sobrenadante de las Sf9 transfectadas se genera un inoculo de trabajo cuya potencia se determina por titulación. Este inóculo es utilizado para optimizar las condiciones de producción de la proteína recombinante. Actualmente estamos trabajando en la purificación de la NP recombinante mediante columnas de intercambio iónico. Con la proteína purificada se formulará una vacuna experimental que será probada en ratones. Se contempla la utilización de diversos adyuvantes con probada efectividad para inducir inmunidad celular y la optimización de la vía de administración mas adecuada. CONCLUSION: Una vacuna ideal contra la gripe debería inducir cobertura contra una más amplia variedad de cepas, ser de producción fácil y económica. Teniendo en cuenta estas premisas se ha establecido un proyecto en colaboración entre en Cevan, el laboratorio de virología de la UNQ y el laboratorio de virología del Imbecu , para el desarrollo de la producción de una vacuna recombinante contra la gripe. Este trabajo describe los avances realizados en la producción de la NP en células de insectos mediante el sistema de baculovirus.