Metilación y expresión de TP73 en carcinomas de mama

NADIN SB; GÓMEZ LC; MAYRA L. SOTTILE; MARZESE D; MARINA FLAMINI; FRANCISCO E. GAGO; OROZCO J; TELLO O; ROQUE M; LAURA M. VARGAS ROIG

Mendoza

Jornada; XIII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo, noviembre 2014; 2014

Facultad de Ciencias Médicas-Universidad Nacional de Cuyo

En el año 2013, el Programa Nacional para el Control del Cáncer de Mama creado por el Ministerio de Salud de la Nación propuso reducir la morbimortalidad por esta patología, que se mantiene estable en Argentina desde 1980, produciendo alrededor de 5.400 muertes anuales [Viniegra M 2011]. Una de las estrategias consiste en garantizar el tratamiento adecuado y oportuno de las pacientes, es decir que no resulte insuficiente ni excesivo. Para ello es necesario que el diagnóstico de la agresividad biológica del tumor sea lo más preciso posible. En algunas circunstancias, como es el caso de los estadíos avanzados, donde las pacientes presentan infiltración tumoral de los ganglios linfáticos, la decisión de realizar quimioterapia está consensuada. Sin embargo, en aquellas pacientes en estadíos tempranos de la enfermedad, donde no existe invasión tumoral de los ganglios linfáticos y cuyos tumores expresan receptores hormonales, la decisión sobre la adición de quimioterapia a la hormonoterapia es controvertida. En este último grupo de pacientes la correlación de los resultados de estudios genómicos con las variables clínico-patológicas clásicas representa un gran avance en la decisión terapéutica. Análisis retrospectivos han demostrado la capacidad de las firmas genómicas para clasificar a las pacientes en categorías de riesgo sumando valor pronóstico a las variables clínico-patológicas clásicas: tamaño tumoral, grado tumoral o histológico y compromiso de ganglios linfáticos regionales. Hemos observado en tumores de mama triple negativos (que no expresan receptores de estrógeno ni progesterona ni HER2) se ha observado un perfil de metilación tumoral específico definido por la metilación de 5 genes (entre los que se encuentra p73) y la no metilación de 11 genes [Branham MT. Oncogenesis 1: e17, 2012]. También se ha observado que la metilación aberrante del gen TP73 (en la región +258 pb) en carcinomas ductales infiltrantes correlacionó con alto grado histológico que es uno de los principales marcadores de mal pronóstico [Marzese DM. J Molecular Diagnostics 14: 613, 2012]. El gen p73 pertenece a la familia de p53 [Collavin L. Cell Death Differ 17: 901, 2010]. Desde su descubrimiento en 1997, se ha estudiado el gen p73 debido a que puede compensar la pérdida de función de p53. Después de un daño al ADN, p73 puede desencadenar la detención del ciclo celular, senescencia y apoptosis promoviendo la transcripción de varios genes blanco de p53. Sin embargo, a diferencia de p53 que se encuentra mutado en más del 50% de los tumores humanos, p73 raramente está mutado (menos del 1%), convirtiéndolo en un interesante blanco de terapias antitumorales [Bisso A. Current Pharmaceutical Design. 17: 578, 2011]. OBJETIVO: Determinar si la metilación del gen TP73 en carcinomas mamarios se relaciona con su expresión proteica. MÉTODOLOGÍA: Pacientes: Hasta la fecha se incorporaron en el estudio los tumores de 23 pacientes con cáncer de mama. Estas pacientes corresponden a un grupo de 69 pacientes inicialmente estudiadas en el protocolo ?Estudio del silenciamiento epigenético de genes supresores tumorales en cáncer de mama? que junto con el correspondiente consentimiento informado fueron aprobados por el Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo. Ninguna paciente recibió tratamiento previo a la cirugía. Metilación: La metilación del gen TP73 en estas muestras ha sido reportada previamente [Marzese DM. J Molecular Diagnostics 2012]. Inmunohistoquímica: Se realizaron cortes de 5 µm de los tejidos incluidos en parafina. La recuperación antigénica se realizó con 0,01 M buffer citrato, pH 6. Las muestras se incubaron con el anticuerpo primario anti-p73 (Abcam) durante toda la noche a 4°C y luego con el segundo anticuerpo anti-conejo y el complejo avidina-biotina peroxidasa (Elite Vectastain ABC kit, Vector). La inmunotinción se realizó con 0,5 mg/mL de diaminobencidina/0,01% de peróxido de hidrógeno y la contratinción con Hetamoxilina de Harris. Los preparados fueron evaluados utilizando un microscopio Nikon Eclipse E200 (Japan). La inmunotinción se evaluó según intensidad y proporción utilizando el siguiente puntaje: a) intensidad: sin tinción 0, tinción débil 1, tinción moderada 2 y tinción fuerte 3; y b) proporción: 66% = 4 [Vargas Roig LM. Molecular Oncology 2:102, 2008]. Se consideró positiva la expresión cuando el puntaje total fue ≥3. Análisis estadístico: Se utilizó test de Fisher para evaluar la relación entre la metilación del gen TP73 y la expresión de la proteína p73 (programa GraphPad Prism 5). RESULTADOS: Se realizó la evaluación de la expresión de la proteína p73 en los tumores de las 23 pacientes. En un caso (CM65) se evaluaron dos muestras debido a que la paciente presentaba carcinoma bilateral. En la Tabla 2 se presentan los resultados de la metilación de dos dinucleótidos citosina ? guanina (CpGs) diferentes en el gen TP73: La primera ubicada a 25 pares de bases [pb; TP73 (+25)]y la segunda a 258 pb [TP73 (+258)] luego del sitio de inicio de la transcripción (+25) junto con la expresión de la proteína p73. En 12 casos se observó metilación de p73 (+258) y solamente en 2 casos metilación de p73 (+25). En 3 muestras no se pudo evaluar la expresión de p73 porque no se observaron células tumorales en el taco de parafina seleccionado. En los 3 casos donde no se expresó la proteína p73 en las células tumorales, el gen TP73 (+258) estaba metilado. Sin embargo, en el 67% de los casos, la metilación de una o de las dos regiones estudiadas no se relacionó con la ausencia o disminución de la expresión proteica. En la Figura 1 se presenta un ejemplo de la inmunotinción de P73 en una muestra de carcinoma ductal invasor (paciente CM26), donde se observa expresión nuclear de elevada intensidad y proporción (imagen tomada con objetivo de 40x). Este tumor presentaba metilación TP73 (+258) y TP73 (+25). CONCLUSIONES: La falta de correlación entre los resultados obtenidos (metilación y expresión del gen) puede deberse, en parte a la heterogeneidad del tumor, recordando que los estudios genómicos y proteómicos se realizaron en dos muestras distintas tomadas de la misma región tumoral y al bajo número de casos analizados.