EFECTO NO GENÓMICO DEL ÁCIDO RETINOICO EN LA MIGRACIÓN DE CÉLULAS DE CÁNCER DE MAMA HUMANO

SHORTREDE J; SANCHEZ A; GAGO F; VARGAS ROIG L; FLAMINI M

Mendoza

Jornada; XIII Jornadas de Investigacion Facultad de Ciencias Medicas (FCM). UNCuyo; 2014

INTRODUCCIÓN El cáncer de mama es la neoplasia maligna más frecuente en mujeres siendo las metástasis la causa del 98% de las muertes. La expresión del receptor de ácido retinoico beta (RARβ) se encuentra reducida o ausente en el 50% de los carcinomas de mama invasores, asociándose dicha pérdida con infiltración de ganglios linfáticos. En ensayos previos realizados por nuestro grupo de trabajo observamos que el ácido retinoico (AR), principal ligando de los receptores de ácido retinoico (RAR), participa en el proceso metastásico inhibiendo la migración vía RARβ reduciendo la expresión de diferentes proteínas involucradas en la motilidad celular (moesin-FAK). Nuestra hipótesis actual es que el AR tendría, además de los efectos genómicos ya demostrados por nuestro laboratorio, efectos no genómicos a tiempos cortos relacionados con la adhesión, motilidad y morfología en células de cáncer de mama. Objetivos: El objetivo principal del presente trabajo es investigar si existe un efecto no genómico del AR activando proteínas involucradas en la adhesión y posterior migración de células de cáncer de mama. Objetivos específicos: 1- Investigar si AR regula, de manera no genómica, la activación y fosforilación de moesin y FAK en células de cáncer de mama T47D. 2- Identificar el mecanismo molecular por el cual el AR regularía/modularía, mediante fosforilaciones específicas, la actividad de moesin y FAK. 3- Determinar el rol del AR en la adhesión de células de cáncer de mama tratadas o no con inhibidores específicos. METODOLOGÍA Cultivo celular: La línea celular de cáncer de mama T47D se cultivó en RPMI 1640 suplementado con L-glutamina (2 mM) y 10% de SFB. Previo a los tratamientos, las células se mantuvieron 12-24hs en un medio sin suero fetal bovino. Se realizaron tratamientos tiempo dependencia con AR. Además utilizamos los inhibidores de vías no genómicas involucradas en la motilidad celular. PTX (inhibidor de proteína G), PP2 (inhibidor específico de c-Src), FAKi inhibidor de FAK, Wortmanina (WM, inhibidor de PI3K), Y-27632 (inhibidor específico de ROCK-2 quinasa), PD98059 (inhibidor de la vía de las MAP-Kinasas). Western Blot: Los lisados celulares se separaron por SDS-PAGE. Se utilizaron los anticuerpos: pFAK (397) y pMoesin (598) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Los anticuerpos primarios y secundarios fueron incubados en las membranas con las técnicas convencionales. La inmunodetección de las bandas proteicas se realizó por quimioluminiscencia utilizando un equipo ChemiDoc TM XRS+ (BioRad-USA). Ensayo de adhesión celular: Se sembraron quinientas mil células/pocillo en placas de 6 pocillos previamente recubiertos con gelatina estéril al 1% (Sigma-Aldrich) y se expusieron a diferentes tratamientos. Las células se incubaron a 37 °C y luego de 1 hora se lavaron con PBS para eliminar cualquier célula no adherente. Las células adheridas se fijaron con paraformaldehído al 4% y se tiñeron con Giemsa. Las imágenes fueron capturados usando un microscopio Nikon Eclipse E200 acoplado a una cámara digital de alta resolución 590CU 5.0M CCD. Análisis estadístico: Todos los valores se expresaron como media ± desviación estándar. Los análisis estadísticos y gráficos se realizaron utilizando los software GraphPad Prism 6.0 e InStat GraphPad 3.0 ® (CA, USA). Los experimentos se realizarán por triplicado y las diferencias estadísticas entre los valores medios se determinarán mediante ANOVA, seguido por Fisher. Se considerarán estadísticamente significativos valores de P