IMBECU   20882
INSTITUTO DE MEDICINA Y BIOLOGIA EXPERIMENTAL DE CUYO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Evaluación de la Respuesta Inmune Humoral Generada por la Infección de Leishmania amazonensis en Ratones BALB/c
Autor/es:
CARGNELUTTI, DIEGO; SALOMON MARIA CRISTINA; SANCHEZ, VICTORIA; SCODELLER EDUARDO
Lugar:
Mendoza
Reunión:
Jornada; XII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo; 2012
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo
Resumen:
INTRODUCCIÓN Los ensayos de desafío de animales susceptibles a un patógeno forman parte del sistema para evaluar la eficacia de las vacunas experimentales contra el mismo. La determinación de las dosis infectivas para utilizar en los ensayos de desafío en el sistema BALB/c ? Leishmania amazonensis, es fundamental dada la elevada susceptibilidad de esta cepa murina a la infección por L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL). El objetivo del presente trabajo fue evaluar parámetros clínicos e inmunológicos generados por la infección con distintas dosis de L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL) en ratones BALB/c; con el propósito de optimizar los ensayos de desafío para la evaluación de formulaciones vacunales experimentales contra la leishmaniosis. MÉTODOS Cultivo de parásitos, inoculación subcutánea y medición de las lesiones Se mantuvo la infectividad de la cepa de L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL) para el modelo murino, mediante  pasajes seriados en la almohadilla plantar derecha (APD) de ratones BALB/c. El aislamiento de los parásitos infectantes (promastigotes) se realizó sembrando el líquido de punción de la APD en medio NNN. Durante la fase de crecimiento exponencial se realizó la cosecha y el lavado de los promastigotes en PBS 1X. Éstos se resuspendieron en PBS y se ajustaron por conteo en cámara de Neubauer. Se inocularon por vía subcutánea en la APD dosis de 1x103 promastigotes/animal y 1x106 promastigotes/animal en un volumen de 50 μl. Al grupo control, se le administró 50 μl/animal de PBS 1X.  A partir del día 7 y hasta el día 70 postinfección, se determinó la tumefacción progresiva de la APD utilizando un espesímetro. Además, se registró el espesor de la pata contralateral y se calculó la diferencia (delta, Δ) entre ambas patas como parámetro de respuesta inflamatoria. Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA) La respuesta inmune humoral inducida por la infección de L. amazonensis fue evaluada midiendo la densidad óptica (OD) de IgG total y de los isotipos IgG1 e IgG2a por ELISA directo. Placas de 96 pocillos se sensibilizaron con 2 μg de un homogenato proteico de L. amazonensis y se incubaron por 12 horas a 4°C. Luego se bloquearon con 5% de leche (en polvo descremada) en PBS 1X y posteriormente las placas se incubaron por una hora a 37°C con las muestras de suero de los animales infectados en una dilución 1/50. Como segundo anticuerpo se usaron sueros específicos anti IgG, IgG1 e IgG2a conjugados con peroxidasa de rábano. Se reveló con tetrametil bencidina, y las densidades ópticas (OD) se determinaron a 450nm. RESULTADOS Evaluación de la tumefacción generada en el sitio de infección La tumefacción en la APD, se evaluó durante 70 días postinoculación. Al finalizar este período se encontraron diferencias significativas (p< 0,001; ANOVA) entre las  dosis en estudio. Los ratones infectados con 1x106 promastigotes/animal, presentaron una mayor velocidad del desarrollo de la  tumefacción, como así también un mayor espesor de la APD hasta la semana 8 postinoculación, al compararlo con el grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal. Después de la semana 8, se observó que el grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal registró un incremento de la tumefacción llegando a igualar al grupo infectados con 1x106 promastigotes (Figura 1). Respuesta inmune humoral En la evaluación, en la semana 10 postinfección, de la respuesta inmune humoral   a la infección por L. amazonensis, se observó seroconversión en ambos grupos, pero se registró un incremento significativo (p<0,001) en la producción de IgG anti-antígenos totales de Leishmania (ATL) en el grupo infectado con 1x106 promastigotes/animal, mientras que el grupo inoculado con 1x103 promastigotes/animal registró una menor producción de IgG anti-ATL (Figura 2). Al evaluar los distintos isotipos de IgG  (IgG1 e IgG2a) generados luego de la infección, registramos una mayor producción de IgG2a, estadísticamente significativa (p<0,05) en el grupo infectado con una dosis de 1x106 promastigotes/animal (Figura 3 A).No se registraron diferencias estadísticamente significativas en la producción de IgG1 entre los grupos infectados (Figura 3 B).   El isotipo IgG1 se correlaciona con un perfil inmunológico del tipo Th2, mientras que el isotipo IgG2a se correlaciona con un perfil Th1, el cálculo de la razón IgG1/IgG2a nos ayuda a definir el fenotipo de las células T generado luego de la infección. Sabiendo que el principal mecanismo de defensa contra los protozoarios del género Leishmania está dado por una respuesta inmune celular del tipo Th1, es que utilizamos la razón IgG1/IgG2a como indicador de una respuesta Th1 o Th2. Al analizar la razón IgG2a/IgG1 entre los distintos grupos de ratones infectados, registramos un incremento de la misma en el grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal (Figura 3 C).   CONCLUSIONES El inóculo de 1x106 promastigotes/animal generó una rápida tumefacción en el sitio de inoculación, sin embargo a partir de la semana 8 postinfección se pudo registrar un incremento de la tumefacción en el grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal (Figura 1). Por otra parte, en diferentes estudios realizados durante la infección por distintas especies de Leishmania en humanos y en modelos experimentales murinos, se ha observado que un aumento en los niveles de IgG total se correlacionaría no sólo con fallas para proveer protección sino que también contribuiría a la progresión de la enfermedad, mientras que una disminución de los títulos se asociaría a mejoría o a efectividad del tratamiento. En el presente trabajo, los hallazgos referidos a la producción  de IgG total (Figura 2) y sus subtipos (Figura 3 A y 3 B) apoyan los hallazgos clínicos encontrados, ya que la dosis infectiva de 1x106 promastigotes/animal presentan valores de OD promedio superiores a los obtenidos en los sueros de los animales infectados con 1x103 promastigotes/animal; sin embargo para este grupo la razón IgG1/IgG2a fue mayor a la del grupo infectado con 1x106 promastigotes/animal, y puede ser correlacionado con el desarrollo de una respuesta del tipo Th2 y un incremento de la patología en este grupo a partir de la semana 8 postinfección. Ensayos complementarios, referidos a la evaluación de la respuesta inmune celular, nos permitirán profundizar en los mecanismos relativos al hospedador capaz de regular la respuesta a la infección.