IMBECU   20882
INSTITUTO DE MEDICINA Y BIOLOGIA EXPERIMENTAL DE CUYO
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Evaluación de la Respuesta Inmune Humoral Generada por la Infección de Leishmania amazonensis en Ratones BALB/c
Autor/es:
CARGNELUTTI, DIEGO; SALOMON MARIA CRISTINA; SANCHEZ, VICTORIA; SCODELLER EDUARDO
Lugar:
Mendoza
Reunión:
Jornada; XII Jornadas de Investigación de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Nacional de Cuyo; 2012
Institución organizadora:
Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Cuyo
Resumen:
INTRODUCCIÓN
Los ensayos de desafío de animales susceptibles a un patógeno forman
parte del sistema para evaluar la eficacia de las vacunas experimentales
contra el mismo.
La determinación de las dosis infectivas para utilizar en los ensayos de
desafío en el sistema BALB/c ? Leishmania amazonensis, es fundamental
dada la elevada susceptibilidad de esta cepa murina a la infección por
L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar parámetros clínicos e
inmunológicos generados por la infección con distintas dosis de L.
amazonensis (MHOM/VE/84/MEL) en ratones BALB/c; con el propósito de
optimizar los ensayos de desafío para la evaluación de formulaciones
vacunales experimentales contra la leishmaniosis.
MÉTODOS
Cultivo de parásitos, inoculación subcutánea y medición de las lesiones
Se mantuvo la infectividad de la cepa de L. amazonensis (MHOM/VE/84/MEL)
para el modelo murino, mediante pasajes seriados en la almohadilla
plantar derecha (APD) de ratones BALB/c. El aislamiento de los parásitos
infectantes (promastigotes) se realizó sembrando el líquido de punción
de la APD en medio NNN. Durante la fase de crecimiento exponencial se
realizó la cosecha y el lavado de los promastigotes en PBS 1X. Éstos se
resuspendieron en PBS y se ajustaron por conteo en cámara de Neubauer.
Se inocularon por vía subcutánea en la APD dosis de 1x103
promastigotes/animal y 1x106 promastigotes/animal en un volumen de 50
μl. Al grupo control, se le administró 50 μl/animal de PBS 1X. A partir
del día 7 y hasta el día 70 postinfección, se determinó la tumefacción
progresiva de la APD utilizando un espesímetro. Además, se registró el
espesor de la pata contralateral y se calculó la diferencia (delta, Δ)
entre ambas patas como parámetro de respuesta inflamatoria.
Ensayo de inmunoadsorción ligado a enzimas (ELISA)
La respuesta inmune humoral inducida por la infección de L. amazonensis
fue evaluada midiendo la densidad óptica (OD) de IgG total y de los
isotipos IgG1 e IgG2a por ELISA directo. Placas de 96 pocillos se
sensibilizaron con 2 μg de un homogenato proteico de L. amazonensis y se
incubaron por 12 horas a 4°C. Luego se bloquearon con 5% de leche (en
polvo descremada) en PBS 1X y posteriormente las placas se incubaron por
una hora a 37°C con las muestras de suero de los animales infectados en
una dilución 1/50. Como segundo anticuerpo se usaron sueros específicos
anti IgG, IgG1 e IgG2a conjugados con peroxidasa de rábano. Se reveló
con tetrametil bencidina, y las densidades ópticas (OD) se determinaron a
450nm.
RESULTADOS
Evaluación de la tumefacción generada en el sitio de infección
La tumefacción en la APD, se evaluó durante 70 días postinoculación. Al
finalizar este período se encontraron diferencias significativas (p<
0,001; ANOVA) entre las dosis en estudio. Los ratones infectados con
1x106 promastigotes/animal, presentaron una mayor velocidad del
desarrollo de la tumefacción, como así también un mayor espesor de la
APD hasta la semana 8 postinoculación, al compararlo con el grupo
infectado con 1x103 promastigotes/animal. Después de la semana 8, se
observó que el grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal registró
un incremento de la tumefacción llegando a igualar al grupo infectados
con 1x106 promastigotes (Figura 1).
Respuesta inmune humoral
En la evaluación, en la semana 10 postinfección, de la respuesta inmune
humoral a la infección por L. amazonensis, se observó seroconversión
en ambos grupos, pero se registró un incremento significativo
(p<0,001) en la producción de IgG anti-antígenos totales de
Leishmania (ATL) en el grupo infectado con 1x106 promastigotes/animal,
mientras que el grupo inoculado con 1x103 promastigotes/animal registró
una menor producción de IgG anti-ATL (Figura 2).
Al evaluar los distintos isotipos de IgG (IgG1 e IgG2a) generados luego
de la infección, registramos una mayor producción de IgG2a,
estadísticamente significativa (p<0,05) en el grupo infectado con una
dosis de 1x106 promastigotes/animal (Figura 3 A).No se registraron
diferencias estadísticamente significativas en la producción de IgG1
entre los grupos infectados (Figura 3 B).
El isotipo IgG1 se correlaciona con un perfil inmunológico del tipo Th2,
mientras que el isotipo IgG2a se correlaciona con un perfil Th1, el
cálculo de la razón IgG1/IgG2a nos ayuda a definir el fenotipo de las
células T generado luego de la infección. Sabiendo que el principal
mecanismo de defensa contra los protozoarios del género Leishmania está
dado por una respuesta inmune celular del tipo Th1, es que utilizamos la
razón IgG1/IgG2a como indicador de una respuesta Th1 o Th2.
Al analizar la razón IgG2a/IgG1 entre los distintos grupos de ratones
infectados, registramos un incremento de la misma en el grupo infectado
con 1x103 promastigotes/animal (Figura 3 C).
CONCLUSIONES
El inóculo de 1x106 promastigotes/animal generó una rápida tumefacción
en el sitio de inoculación, sin embargo a partir de la semana 8
postinfección se pudo registrar un incremento de la tumefacción en el
grupo infectado con 1x103 promastigotes/animal (Figura 1). Por otra
parte, en diferentes estudios realizados durante la infección por
distintas especies de Leishmania en humanos y en modelos experimentales
murinos, se ha observado que un aumento en los niveles de IgG total se
correlacionaría no sólo con fallas para proveer protección sino que
también contribuiría a la progresión de la enfermedad, mientras que una
disminución de los títulos se asociaría a mejoría o a efectividad del
tratamiento. En el presente trabajo, los hallazgos referidos a la
producción de IgG total (Figura 2) y sus subtipos (Figura 3 A y 3 B)
apoyan los hallazgos clínicos encontrados, ya que la dosis infectiva de
1x106 promastigotes/animal presentan valores de OD promedio superiores a
los obtenidos en los sueros de los animales infectados con 1x103
promastigotes/animal; sin embargo para este grupo la razón IgG1/IgG2a
fue mayor a la del grupo infectado con 1x106 promastigotes/animal, y
puede ser correlacionado con el desarrollo de una respuesta del tipo Th2
y un incremento de la patología en este grupo a partir de la semana 8
postinfección.
Ensayos complementarios, referidos a la evaluación de la respuesta
inmune celular, nos permitirán profundizar en los mecanismos relativos
al hospedador capaz de regular la respuesta a la infección.