La aplicación de una hipertermia moderada incrementa la sensibilidad a cisplatino en células tumorales de colon con un sistema MMR competente

SOTTILE, M. L.; CUELLO CARRION F. D.; CIOCCA D. R.; VARGAS ROIG L. M.; NADIN S. B.

Mendoza

Jornada; Reunión Conjunta: III Foro Provincial de Investigación para la Salud Ministerio de Salud, XII Jornadas de Investigación de la F. C. Médicas UNCuyo y I Jornada de Investigación del Hospital Universitario UNCuyo; 2012

F. C. Médicas UNCuyo

INTRODUCCIÓN: Una hipertermia moderada (39-42°C) es capaz de inducir la expresión de proteínas de golpe de calor (Heat Shock Proteins: HSPs). HSPB1 (HSP27) y HSPA1A (HSP72) intervienen en la proliferación y supervivencia celular; además han sido implicadas en la resistencia a drogas antineoplásicas, como cisplatino (cPt). La citotoxicidad del cPt es mediada por la formación de uniones cruzadas, las cuales son reconocidas por componentes del sistema de reparación de malos apareamientos en el ADN o Mismatch Repair (MMR). Defectos en proteínas de este sistema, como hMLH1 o hMSH2, se han asociado con resistencia al cPt. Recientemente, hemos reportado que una hipertermia moderada causa la acumulación nuclear de HSPB1 y HSPA1A y afecta la localización subcelular de hMLH1 y hMSH2 en células tumorales de colon humanas competentes en el sistema MMR. Sin embargo, las implicancias de las HSPs en la reparación del daño inducido por cisplatino no se han determinado aún en células tumorales humanas competentes/incompetentes en el sistema MMR. OBJETIVO: Analizar en líneas celulares tumorales de colon humano deficientes/ no deficientes en el sistema MMR, la expresión génica de HSPB1, HSPA1A, HSF1, hMLH1 y hMSH2, el daño al ADN y la senescencia, luego del tratamiento con cPt solo o combinado con una moderada hipertermia. METODOLOGÍA: Líneas Celulares. HCT116, HCT116+ch2 (MMR deficientes) y HCT116+ch3 (MMR no deficientes). Las células HCT116+ch2 y HCT116+ch3 derivan de la línea celular de adenocarcinoma colorectal humano HCT116 que posee una mutación hemicigota en el codón 252 de hMLH1, originando una proteína truncada (no funcional). La línea celular HCT116+ch3 complementada con el cromosoma 3 (copia wild-type del gen hMLH1), es MMR competente y la línea celular HCT116+ch2 complementada con el cromosoma 2, MMR deficiente. Las células fueron mantenidas en medio IMDM (Gibco-Life Technologies, NY, USA) suplementado con 10% de suero fetal bovino (Gibco). Las células HCT116+ch2 y HCT116+ch3 fueron cultivadas en presencia de 400 µg/mL de G418 (Gibco).Procedimiento experimental: Un grupo de células fue tratado con 10 µM de cPt (1 h) y otro grupo fue expuesto a una moderada hipertermia (HS, 42°C, 1 h) 24 horas antes del cPt. Luego de los tratamientos, se realizaron cosechas a tiempo 0 (inmediatamente después del cPt), 4 y 24 (4 y 24 h después del cPt). Extracción de ARN y qRT-PCR:  El ARN total fue obtenido utilizando Trizol según las instrucciones del fabricante (Invitrogen Life Technologies). Para la retrotranscripción se utilizó la enzima M-MLV (Invitrogen). Las expresiones génicas fueron determinadas mediante qPCR.  Los niveles relativos de ARNm se calcularon según:  2-∆∆CT= [(CT gen en la muestra ? CT beta-actina en la muestra) ? (CT gen en el control ? CT  beta-actina en el control)] (Livak K.J. et al, Methods 25, 402-408, 2001). Alkaline comet assay: Se realizó según el procedimiento descripto por nuestro grupo de trabajo (Nadin S.B. et al, J Histochem Cytochem 49, 1183-1186, 2001). Se evaluó el daño al ADN utilizando un score visual (Branham M.T., Nadin S.B., et al, Mutat. Res. 560, 11-17, 2004). Para analizar uniones cruzadas de cPt se adicionó 30 mM H2O2 (1 h at 4°C) para inducir rupturas de cadena. Por lo tanto, el daño originado por cPt se determinó por la diferencia entre la migración del ADN de células expuestas a H2O2 y las células tratadas con cPt y H2O2. Se calculó el porcentaje de aductos de cPt como: [1- (MMcPt ? MMC)/(MMCH ? MMC)]x100 (Arora S. et al, DNA Repair 9, 745-753, 2010). MM: Media de Migración del ADN. cPt: muestra tratada con cPt + H2O2. C: control, sin tratamientos. CH: control + H2O2. Los resultados fueron normalizados con respecto a la muestra tratada con cPt a tiempo 0 (100%). Actividad de SA-beta-Galactosidasa. Se efectuó el procedimiento descripto por F. Debacq-Chainiau (Nature Protocols vol 4: 1799-1806, 2009). Las células fueron fijadas en 2% formaldehído (vol/vol) y 0,2% glutaraldehído (vol/vol) en PBS. Posteriormente fueron incubadas con 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido (X-gal) a pH 6. Las imágenes fueron capturadas con un microscopio Nikon E-200 (Japan). Análisis estadístico: Se utilizó el test ANOVA con el  post-test de Bonferroni (GraphPad PRISM program, versión 5.0, San Diego, CA, USA). Valores de P<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. RESULTADOS: 1- Efecto de hipertermia y cisplatino en la expresión génica de HSP27, HSP72, HSF1, hMLH1 y hMSH2 en células tumorales de colon humanas competentes/incompetentes en el sistema MMR.  El cisplatino redujo la expresión de  HSPB1 en células MMR competentes (HCT116+ch3). Sin embargo, el tratamiento con cisplatino, incrementó la expresión de HSPA1A en células competentes e incompetentes en el sistema MMR. 24 h después del cisplatino, el tratamiento térmico incrementó los niveles de HSF1 y de hMLH1 en células HCT116+ch3. 2- Daño al ADN inducido por cisplatino: efecto de  la hipertermia. La aplicación de una hipertermia moderada redujo aproximadamente 30% la formación de uniones cruzadas de cisplatino en células MMR competentes (HCT116+ch3). 24 h después del cisplatino, quedaron por reparar cerca del 70% de los aductos en la línea MMR competente y 95% en la MMR deficiente. Por lo tanto, el tratamiento térmico no disminuyó el porcentaje de aductos de cisplatino en la línea celular MMR incompetente. 3- Senescencia inducida por hipertermia y cisplatino. El golpe de calor incrementó la senescencia en células MMR competentes expuestas a cisplatino, efecto no observado en células MMR deficientes. CONCLUSIONES: Una hipertermia moderada antes del tratamiento con cisplatino redujo la formación de uniones cruzadas en células con un sistema MMR funcional, incrementando la sensibilidad a la droga (hipótesis de ciclos fútiles de reparación). Se observó en estas células un incremento de la senescencia y de los niveles de expresión génica de HSF1. Sin embargo, el tratamiento térmico no modificó la cantidad de aductos y la sensibilidad a la droga en la línea celular deficiente en el sistema MMR.