Hsp70 en la regulación de las subunidades Nox4/p22phox NAD(P)H-oxidasa y el citoesqueleto en células CMLV de SHR tratadas con Losartan

GIL LORENZO AF; BOCANEGRA V; RINALDI TOSI ME; CACCIAMANI VE; BENARDON ME; VALLÉS P

Buenos Aires

Congreso; XIX Congreso Argentino de Hipertensión Arterial; 2012

Sociedad Argentina de Hipertensión Arterial (SAHA)

Hsp70 EN LA REGULACIÓN DE LAS SUBUNIDADES Nox4/p22phox NAD(P)H-OXIDASA Y EL CITOESQUELETO EN CÉLULAS CMLV DE SHR TRATADAS CON LOSARTAN. Gil Lorenzo AF, Bocanegra V, Rinaldi Tosi ME, Cacciamani VE, Benardon ME, Vallés P. Área de Fisiopatología, Facultad de Ciencias médicas, UNCuyo. IMBECU, CONICET. Mendoza. E-mail: andreafernandagillorenzo@gmail.com Introducción La señalización de Angiotensina II en células de músculo liso vascular (CMLV) depende de la interacción del receptor AT1 (AT1R) con Caveolina-1 y de la producción de especies reactivas del oxígeno (ROS) a través del sistema NAD(P)H-oxidasa cuya subunidad Nox4 se expresa en CMLV pero su regulación no es conocida. ROS activa GTPasas pequeñas que intervienen en la regulación del citoesqueleto, engrosando las fibras de estrés y modificando adhesiones focales. Existe evidencia experimental del rol de la proteína chaperona Hsp70 participando en el ensamblaje del citoesqueleto y de su interacción con proteínas de membrana. Objetivo Estudiar la participación de Hsp70 en la regulación de las subunidades Nox4 y p22phox NAD(P)H-oxidasa y la modulación del citoesqueleto, en cultivo de CMLV luego del tratamiento con Losartan. Métodos Cultivos primarios de CMLV mesentéricas SHR y WKY fueron tratados con Losartan durante 45 o 90 min y, estimulados con AII durante 15 o 60 min en presencia o ausencia de Losartan. Grupos: Control (C), Angiotensina II (AII: 100 µmol/L), Losartan (Los: 100 µmol/L) y Losartan más Angiotensina II (L+AII: iguales concentraciones). La expresión y distribución celular de Hsp70, Nox4 y p22, -Actina y Vinculina se analizó por western blot, coinmunoprecipitación e inmunofluorescencia y microscopía confocal. Los resultados se validaron en cultivos silenciados para la expresión de Hsp70 por transfección con vector plasmídico shRNA Hsp70. Grupos controles: Células no transfectadas (nt) y transfectadas con vector vacío pSIREN–RetroQ (ev). Grupos silenciados: Silenciamiento sin tratamiento (Hsp-C), y silenciamiento con tratamientos: Angiotensina II (Hsp-AII), Losartan (Hsp-Los) y Losartan más Angiotensina II (Hsp-L+AII). Resultados Demostramos interacción de receptor AT1 de AII y Caveolina-1 en membrana de SHR tratadas con Losartan. En CMLV SHR observamos translocación de Hsp70 a membrana tras 90 min de exposición a Losartan e interacción con Nox4/p22 con disminución de su expresión y descenso de la forma activa de RhoA y Cdc42. Disminución de Vinculina y desorganización de -Actina hacia su forma soluble (G-Actina) y su colocalización con Hsp70 fue demostrada, en SHR por efecto de Losartan. A fin de confirmar la participación de Hsp70 en la regulación de Nox4/p22 y del citoesqueleto, silenciamos la expresión de Hsp70. En células silenciadas de SHR tratadas con Losartan observamos persistencia en la expresión de Nox4/p22, así mismo el aumento en la actividad de NAD(P)H-oxidasa en SHR estimuladas con AII no fue inhibida por Losartan. Intensa polimerización de Actina con engrosamiento de las fibras de estrés y disminución de Actina-G, con persistencia en la expresión de Vinculina fue demostrado en CMLV SHR silenciadas pretratadas con Losartan y estimuladas con AII. Conclusión Sugerimos la intervención de Hsp70 en la regulación negativa de la expresión y actividad de Nox4/p22phox NAD(P)H-oxidasa, y en la modulación del citoesqueleto, favoreciendo la forma soluble de -Actina y disminuyendo la expresión de Vinculina por efecto de Losartan. Proponemos un rol de la chaperona en el efecto protector de Losartan, mediante la disminución del estrés oxidativo asociado a la desorganización del citoesqueleto de Actina.