INCITAP   20787
INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA TIERRA Y AMBIENTALES DE LA PAMPA
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Desglicosilación enzimática de flavonoides en mezclas acuosas de líquidos altamente eutécticos, posible medio para escalar reacciones de transglicosilación
Autor/es:
WEIZ G; FRIES A; MAZZAFERRO L; MULLER J; MULLER M; BRECCIA JD; BRAUN LE; DOMINGUEZ DE MARIA P
Lugar:
Buenos Aires
Reunión:
Simposio; Simposio Argentino de Bioprocesos; 2016
Resumen:
Resumen La desglicosilación del flavonoide hesperidina fue llevada a cabo con el biocatalizador 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa en líquidos altamente eutécticos (DES). Estos solventes se caracterizan por ser biodegradables y amigables para el ambiente. Los DES utilizados están compuestos por la combinación de colina con glicerol, etilenglicol y urea. Aunque la viscosidad de los DES respecto a la de sus componentes aislados es menor, la desglicosilación enzimática aumentó significativamente en presencia de los polialcoholes (etilenglicol y glicerol) mientras que colina produjo un efecto deletéreo. El incremento de la actividad enzimática se relacionó a la reacción de transglicosilación sobre los polialcoholes. Los productos de reacción analizados por espectrometría de masa, mostraron que en ambos casos la enzima fue capaz de transglicosilar uno de los grupos oxidrilos. El gliceril-rutinósido es un potencial edulcorante de bajas calorías y además podría ser empleado como aditivo para productos cosméticos.Palabras clave DES; Glicosil hidrolasas; Glicerol, Etilenglicol, Flavonoides.1. Introducción Hesperidina (hesperetina 7-O-α-ramnopiranosil-β-glucopiranósido) es un flavonoide glicosilado abundante en los frutos cítricos y contribuye a la opacidad y sabor amargo de los jugos de frutas. En la industria alimentaria la desglicosilación enzimática es necesaria para clarificar estos productos. Las diglicosidasas escinden el disacárido del flavonoide en una reacción. Por otro lado, algunas de ellas son capaces de transglicosilar el disacárido a un grupo oxidrilo aceptor. En este último caso se tornan herramientas prometedoras para la síntesis de glicósidos bioactivos. Los líquidos altamente eutécticos (DES) son complejos entre un catión de amonio cuaternario y un donor de hidrogeno. Los DES establecen una alternativa a los sistemas acuosos para incrementar la solubilidad de los flavonoides y aumentar su disponibilidad en la catálisis. Este trabajo explora la actividad de hidrólisis y transglicosilación de la enzima 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa en medios que contienen DES o sus componentes.2. Metodología Síntesis de DES: colina (CH):urea (relación molar 1:2), agitación 40 rpm, 90ºC por 1 hora. CH: glicerol (relación molar 1:2) sin agitación a 70ºC por 30 min. CH:etilenglicol (relación molar 1:2) sin agitación durante 1 minuto a 80ºC. Reacciones enzimáticas: La reacción de hidrólisis se realizó en los DES CH:urea, CH:glicerol, CH:etilenglicol y en los solventes que los componen (glicerol y etilenglicol). Hesperidina (1.8 mM) y el catalizador fueron incubados en 50 mM buffer fosfato de sodio pH 6.0 durante 1 h a 60°C. La reacción de transglicosilación se realizó en etilenglicol o glicerol (40% v/v) incubados con hesperidina (1.8 mM) y 0.02 U/mL α-ramnosil-β-glucosidasa en 50 mM de buffer sodio citrato pH 5 por 1 h a 60 °C.3. Resultados La desglicosilación enzimática de hesperidina fue llevada a cabo en un medio con diferentes proporciones de los DES (CH:glicerol, CH:etilenglicol y CH:urea) y en presencia de los componentes individuales (Esquema 1). El DES CH:urea fue deletéreo para la enzima. Sin embargo la actividad de la enzima 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa se mantuvo >50% en una proporción de DES 40%. Se demostró que el catión colina afectaba negativamente la actividad enzimática. Por el contrario, en presencia de los componentes etilenglicol y glicerol se produjo un incremento significativo de la actividad enzimática (140% en glicero 40% v/v y 60% en etilenglicol 60%v/v). Este incremento se relacionó con la formación de gliceril?rutinósido. El análisis de los productos de reacción por espectrometría de masa demostró que la enzima fue capaz de tranglicosilar sólo uno de los grupos oxidrilos. La reacción con etilenglicol como aceptor presentó un rendimiento máximo a 50°C después de 23 h obteniéndose con un 77% del producto de transglicosilación. Mientras que glicerol como aceptor, alcanzó un 100% de conversión de hesperidina, donde un 46% fue producto de transglicosilación luego de 23 h a 60 °C. 4. Discusión Los resultados sugieren que un incremento de la solubilidad de hesperidina favorecería la catálisis hasta el punto donde la alta viscosidad de los medios comenzó a ser adverso para el proceso enzimático, presumiblemente debido a las limitaciones de transferencia de masa. Por lo tanto, la baja viscosidad de los DES en comparación con los componentes individuales -glicerol o etilenglicol- pueden ser contrarrestados por el efecto perjudicial de colina. 5. Conclusiones Diferentes DES a base de cloruro de colina se pueden utilizar para procesos biocatalíticos usando glicosidasas en los marcos prácticos de 30-40% DES (v/v). Dada la importancia industrial de los flavonoides, y las ventajas ambientales que el uso de estos co-disolventes puede tener -en comparación con los co-disolventes convencionales (ej. DMSO)- el uso de los DES abre posibilidades para combinar la biocatálisis con industria de alimenticia. Debido a que el glicerol es un subproducto de la síntesis de biodiesel, sería una fuente accesible para la producción de gliceril-glicósidos que poseen usos en la industria cosmética. Esquema 1: Reaccciones catalizadas por 6-O-α -ramnosil-β-glucosidasa.6. Bibliografía Zhao, H., Baker, G.A. y Holmes, S. (2011). Protease activation in glycerol-based deep eutectic solvents. J. Mol. Cat. B: Enzym. 72 163?167.Mazzaferro, L.S., Piñuel, L., Erra-Balsells, R., Giudicessi, S.L. y Breccia, J.D. (2012) Transglycosylation specificity of Acremonium sp. α-rhamnosyl-β-glucosidase and its application to the synthesis of the new fluorogenic substrate 4-methylumbelliferyl-rutinoside. Carbohydr. Res. 347 69?75.EJE TEMATICO: Fermentación microbiana y biotransformaciones