INCITAP   20787
INSTITUTO DE CIENCIAS DE LA TIERRA Y AMBIENTALES DE LA PAMPA
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Clonado y expresión de dos diglicosidasas de interés biotecnológico
Autor/es:
NEHER BÁRBARA D.; MAZZAFERRO LAURA S.; WEIZ GISELA; BRAUN LUCAS E.; OYHENART JORGE, KOTIK MICHAEL; KREN VLADIMIR Y BRECCIA JAVIER D.
Lugar:
Santa Fé
Reunión:
Simposio; 3er Simposio Argentino de Procesos Biotecnológicos; 2014
Institución organizadora:
Universidad Nacional del Litoral
Resumen:
Hesperidina (hesperetina 7-O-α-ramnopiranosil-β-glucopiranosido) es abundante en los frutos cítricos y contribuye a la opacidad y sabor agrio de los jugos. La hidrólisis enzimática con monoglicosidasas se ha empleado para reducir el sabor amargo y para clarificar estos productos. Las diglicosidasas permiten completar la desglicosilación en un solo paso independientemente de las concentraciones diferenciales de los sistemas multienzimáticos. Por otro lado, las diglicosidasas capaces de transglicosilar azúcares son herramientas prometedoras para la síntesis de glicósidos bioactivos a medida. El objetivo de este trabajo fue clonar y expresar dos diglicosidasas capaces de remover la fracción sacarídica del flavonoide hesperidina y una de ellas capaz de trasglicosilar el disacárido sobre aceptores con oxidrilos primarios, secundarios y fenólicos. El origen de estas enzimas fueron la bacteria Actinoplanes sp. SES612 y el hongo Acremonium sp. DSM24697.La enzima recombinante de Actinoplanes presentó actividad frente a los sustratos artificiales 4-metilumbeliferil-rutinosido (4-MUR), p-nitrofenil-α-L-rutinósido (pNR) y el sustrato natural hesperidina, pero no sobre el sustrato rutina. La actividad específica fue igual a la actividad de la proteína wild type (2,23 U/mg). La actividad decrece hasta un 50% luego de 2 ciclos de congelado y descongelado (-20°C, 24h) y respecto a la estabilidad en almacenamiento a 8°C esta perdió 40% de la actividad luego de 10 días.La 6-O-α-ramnosil-β-glucosidasa de Acremonium fue expresada en E. coli y en P. pastoris. Ambas exhibieron actividad hidrolítica frente a los sustratos artificiales 4-metilumbeliferil-rutinosido (4-MUR), p-nitrofenil-α-L-rutinósido (pNR) y el sustrato natural hesperidina. La actividad específica de la proteína recombinante de P. pastoris (4,97 U/mg) fue 4 veces mayor que la de la proteína wild type (1,25 U/mg). La capacidad de transglicosilación no pudo ser detectada con la proteína expresada en el sistema procariota, mientras que la recombiante eucariota presentó esta actividad al igual que la enzima wild type. Considerando que la proteína wild type es una glicoproteína, este resultado podría ser explicado por la no glicosilación de la proteína expresada en el sistema procariota. Por tal motivo, se evaluó si la desglicosilación enzimática de la proteína afectaba la actividad de transglicosilación. La desglicosilación fue significativa con Endo H mientras que la enzima tratada con PNGasa F no mostró diferencias de peso molecular respecto de la parental. No obstante en ninguno de los 2 tratamientos fue afectada la actividad de tranglicosilación o hidrolítica.