IIB   20738
INSTITUTO DE INVESTIGACIONES BIOLOGICAS
Unidad Ejecutora - UE
congresos y reuniones científicas
Título:
Proteínas antimicrobianas: importancia de la citotoxicidad selectiva en proteínas aisladas de papa
Autor/es:
MUÑOZ, FERNANDO F.; MENDIETA, JULIETA R.; PAGANO, MARIANA R.; DALEO, GUSTAVO R.; GUEVARA, MARÍA G.
Lugar:
Mar del Plata, Buenos Aires, Argentina
Reunión:
Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la papa; 2008
Resumen:
El interés de la utilización de los AMPPs (péptidos y proteínas con actividad antimicrobiana) en programas de mejoramiento vegetal se debe a que en actualidad, el alto costo ambiental y económico originado por la utilización de compuestos químicos para la fertilización y el control de enfermedades en los cultivos, a llevado a considerar a la biotecnología, como una alternativa para la producción de plantas con alto grado de resistencia a enfermedades [1-5]. Varios estudios han demostrado que la sobreexpresión de AMPPs en algunas especies conduce a un aumento del grado de resistencia a la infección por patógenos [2-5]. Por otra parte, la utilización de los AMPPs en medicina como "antibióticos naturales"  se basa en que, en la actualidad existe una necesidad urgente de buscar alternativas a los antibióticos sintéticos. Esto es una consecuencia del continuo uso de antibióticos que ha tenido como resultado cepas bacterianas con resistencia múltiple a los mismos y como es de esperarse, complicaciones a la hora de enfrentar el control de enfermedades infecciosas y en especial de enfermedades intrahospitalarias, el cual es aún un problema sin resolver y que se acrecienta día a día [6]. Las StAPs (aspartil proteasas de Solanum tuberosum) integran el grupo de AMPPS. Estas proteínas presentan actividad citotóxica selectiva, ya que causan la muerte de organismos patógenos de papa como el hongo Fusarium solani y  el oomycete Phytophthora infestans, pero no de células de tabaco [7-12]. Conjuntamente, se ha reportado que las StAPs inhiben de manera irreversible el crecimiento de cultivos de cepas bacterianas patógenas de humanos, tales como Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus, pero no son capaces de lisar glóbulos rojos humanos [13]. Estas proteínas poseen en su secuencia de aminoácidos un dominio interno denominado “Inserto Específico de Plantas” (StAsp-PSI) [11], el cual presenta homología estructural con un grupo de proteínas con capacidad de interactuar con lípidos, las “saposin-like proteins” [14], que incluye a las saposinas A, B, C, y D; NK-lisina y granulisina, entre otras [15,16]. Las saposinas están involucradas en la degradación lisosomal de esfingolípidos [17,18], las NK-lisinas poseen actividad antibacteriana y capacidad de lisar células tumorales pero no son capaces de provocar lisis en glóbulos rojos [19] y las granulisinas poseen actividad antimicrobiana [20] y antitumoral [21]. El objetivo de este trabajo fue aportar conocimientos sobre el mecanismo de acción de las StAPs, determinando la actividad citotóxica de la proteína StAsp-PSIr, para finalmente generar nuevas herramientas para el tratamiento de enfermedades infecciosas en los cultivos y en el hombre.    MATERIALES Y MÉTODOS Para llevar a cabo los objetivos propuestos, las proteínas StAP1; StAP3 y StAP-PSIr fueron purificadas a homogeneidad a partir de hojas y tubérculos respectivamente [7, 8, 22]. Las suspensiones de S. aurus, E. coli y B. cereus fueron tratadas con distintas concentraciones tanto de StAP1 como de StAP3 (1.3 µM, 1.8 µM, 3.8 µM, 7.5 µM y 10 µM) y de StAP-PSIr (0.35 µM, 0.71 µM, 2.14 µM,  2.85 µM) durante 6 horas a 37°C. Posteriormente, se sembraron en medio fresco con el fin de cuantificar las unidades formadores de colonias [16]. El IC50 (concentración de proteínas con la cual se observa el 50% de citotoxicidad) fue determinado por extrapolación de la curva dosis respuesta. Paralelamente, eritrocitos humanos frescos fueron tratados con las mismas concentraciones de las tres proteínas cuantificándose posteriormente la liberación de hemoglonina [23].   RESULTADOS Y DISCUSIÓN * Concentración de proteína requerida para reducir la viabilidad de S. aurus, B.cereus y E. coli en un 50% (IC50), calculada a partir de las curvas dosis respuesta obtenidas luego de 6 horas de incubación. Los valores no fueron significativamente diferentes entre si (p <0.01). Los resultados obtenidos muestran que al igual que las StAPs el dominio StAsp-PSIr posee actividad citotóxica selectiva de manera dosis dependiente, interactuando con las membranas de microorganismos tanto patógenos de vegetales (P. infestans; F. solani) (Tabla 1A); como de humanos (Staphylococcus aureus, Escherichia coli y Bacillus cereus) (Tabla 1B); uniéndose en forma directa a la membrana plasmática; provocando cambios en la permeabilidad de la misma y subsecuentemente la muerte celular. La concentración molar a la cual ejerce su actividad microbicida es similar y en algunos casos menor a la descripta para las StAPs. Por otra parte, se pudo demostrar que dicha toxicidad es selectiva ya que en las concentraciones ensayadas no presenta citotoxicidad frente a células BY2 y eritrocitos. Al igual que muchos AMPPs [24-30, 1], la proteína StAsp-PSI presenta un amplio espectro de actividades antimicrobianas lo cual sugiere que la misma, al igual que las StAPs, podrían ser utilizadas en: 1-      Programas de producción vegetal para la generación de plantas transgénicas con resistencia múltiple a patógenos. 2-      Ensayos preclínicos como elementos básicos para la elaboración de nuevas drogas para el tratamiento del cáncer y/o enfermedades infecciosas.