Detección y caracterización de los agentes causales de la Sarna Común de la Papa

CONDE M.E.; ANDREU A.B; ESCARRA A.M.

Mar del Plata. Buenos Aires. Argentina

Congreso; XXIII Congreso de la Asociación Latinoamericana de la Papa. ALAP´08 y VII Seminario sobre el Uso y Comercialización de la Papa; 2008

Asociación Latinoamericana de la Papa

INTRODUCCIÓNLa enfermedad conocida como “Sarna Común de la Papa” (SCP), causada por actinomycetes del género Streptomyces spp. provoca al cultivo importantes pérdidas de rendimiento y calidad comercial de los tubérculos cosechados. Una herramienta importante para el manejo de la enfermedad es la utilización de espacios de plantación libres de estos patógenos o con bajos niveles de inóculo (Wilson, 1999). Por ello es interesante contar con metodologías rápidas y confiables que brinden información acerca de la presencia de Streptomyces en el suelo. También es importante poder establecer en forma rápida e inequívoca la especie de Streptomyces presente, debido a que para especies como S. scabies la práctica de acidificación del suelo es útil para el control de la enfermedad mientras que para S. turgidiscabies no lo es. Métodos basados en reacciones de PCR han sido desarrollados para la detección específica de S. scabies y S. turgidiscabies (Kreuze et al., 1999) pudiendo estas técnicas ser aplicadas al diagnóstico en suelo.Análisis genéticos recientes han postulado un mecanismo común de patogenicidad en actinomycetes. Este mecanismo involucra varios genes de virulencia asociados incluyendo a los relacionados en la biosíntesis de taxtomina (txtAB). La taxtomina se encuentra involucrada en la inhibición de la síntesis de celulosa e induce los síntomas de la SCP a través de la necrosis y de la hipertrofia. Otro de los genes involucrados es nec1 que codifica una proteína que participa en la necrosis y se ha comprobado que existe una fuerte correlación entre la producción de taxtomina y la presencia de nec1 en cepas patogénicas (Lazarovits et al., 2007). Por ello en este estudio se propone estudiar los componentes moleculares del sistema SCP, y desarrollar una metodología basada en técnicas moleculares para la detección temprana de la enfermedad en suelos y en cultivares resistentes a la enfermedad y caracterizar la patogenicidad de los aislamientos de diferentes zonas agroecológicas. MATERIALES Y MÉTODOSAislamiento. Streptomyces sp. fue aislado a partir de lesiones de tubérculos de papa o aislado a partir de muestras de suelo y posteriormente incubado en placas durante 2 semanas a 25ºC en medio de cultivo selectivo para Actinomycetes. Extracción de ADN. Se extrajo ADN total a partir de muestras de suelo mediante la utilización de kit de extracción de ácidos nucleicos UltraClean Soil DNA (Mobio, Laboratorios, Inc.). Colony PCR. Se realizaron ensayos con iniciadores específicos para agentes causales de SCP a partir de colonias aisladas. La reacción multiplex se realizó utilizando 2 µl de ADN molde en una mezcla de reacción (25 µl): 1X PCR buffer (10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl), 1.5 mM MgCl2, 200 mM de cada dNTP, 0.5 mM de cada primer específico y 1 U de Taq Polymerase (Invitrogen). El programa de PCR consistió en un paso de 5 minutos a 95ºC, 35 ciclos de 1minuto a 95ºC – 1 minuto a 52ºC - 1 minuto a 72ºC, y un paso final de elongación de 10 minutos a 72ºC. Ensayos de Patogenicidad. Se cortaron tubérculos de papa de 3 x 2 cm y se lavaron con solución conteniendo hipoclorito al 1%. Luego se dispusieron en cajas de Petri junto con papel de filtro humedecido con agua. Los tubérculos fueron inoculados con colonias de Streptomyces aisladas en agar y colocadas sobre la superficie. RESULTADOS Y DISCUSIÓNCon el fin de desarrollar una metodología basada en reacciones de PCR que permita la detección e identificación de cepas específicas patogénicas causales de Sarna Común de la Papa, se realizaron  diferentes aislamientos de distintas zonas agroecológicas. En la Fig.1A se observan los síntomas severos de la enfermedad en un tubérculo de papa recién cosechado de la variedad Spunta. A partir de los aislamientos tanto de tubérculos como de muestras de suelo, se procedió a la caracterización molecular a través de la amplificación de secuencias específicas de Streptomyces spp. que permiten identificar unívocamente al género estudiado: cstr, gen que se utiliza como control de la presencia de Streptomyces, y txtA y nec1 correspondientes a los genes de patogenicidad (Fig. 1B y C). Como parte de la caracterización de cada uno de los aislamientos realizados a partir de los tubérculos sintomáticos de distintas variedades de papa de la Argentina, se confeccionó una tabla que resume la información y algunos de los resultados obtenidos. Las características recogidas de los distintos aislamientos en este estudio permiten obtener una información muy valiosa de la enfermedad que afecta a la papa y conocer aquellas cepas patogénicas que se encuentran en nuestro país. A partir de los ensayos que se están realizando se va a poder correlacionar la presencia de la enfermedad con la utilización de estrategias adecuadas en el manejo de las variedades de papas a cultivar y la rotación de suelos.  REFERENCIASKreuze, J.F., Suomalainen, S., Paulin, L. and J.P.T Valkonen,. 1999. Phylogenetic analysis of 16S rRNA genes and PCR analysis of the nec1 gene from Streptomyces spp. causing common scab, pitted scab, and netted scab in Finland. Phytopathology 89:462-469. Lazarovits, G., Hill J, Patterson G, Conn K and N Crum. 2007. Edaphic soil levels of mineral nutrients, pH, organic matter and cationic exchange capacity in the geocaulosphere associated with potato common scab. Phytopathology 97: 1071-1082.Wilson, C.R., Ransom, L.M. and B.M Pemberton, 1999. The relative importance of seed-borne inoculum to common scab disease of potato and the efficacy of seed tuber and soil treatments for disease control. J. Phytopathology 147:13-18.