Búsqueda de blancos fisiológicos de SPINK3 en la superficie espermática a través de una estrategia de cosslinking

ALONSO, CAI; ZALAZAR, L; DE CASTRO, R; CESARI, A

Mar del Plata

Congreso; LVIII Reunión Anual SAIC; 2013

Sociedad Argentina de Investigacion Clinica (SAIC)

La capacitación es un proceso clave que deben atravesar los espermatozoides a fin de fecundar al ovocito. Éste consiste en una serie de cambios bioquímicos a nivel intracelular y de membrana que desencadenan la hipermotilidad y la reacción acrosomal. Entre estos cambios se encuentra la eliminación de factores decapacitantes del plasma seminal que están unidos a la superficie espermática evitando que se produzca una capacitación prematura. Una de las moléculas caracterizada por ser decapacitante es SPINK3 (Serin Protease Inhibitor Kazal-type 3), una proteína secretada por la próstata y la vesícula seminal que además de inhibir el ingreso de Ca2+ al espermatozoide, es un inhibidor de serina proteasas que se libera de la superficie en el tracto reproductor femenino. Según reportamos anteriormente, la unión de SPINK3 al espermatozoide es independiente de su capacidad inhibitoria, aunque todavía no hay estudios concluyentes acerca de la identidad de la proteína a la que se une. Utilizando la proteína recombinante SPINK3 fusionada a GST (GST-SPINK3) que carece de actividad inhibitoria de tripsina, se construyó una columna de afinidad inmovilizando GST-SPINK3 a la matriz mediante un crosslinker bifuncional. Ésta fue utilizada como herramienta en la búsqueda del blanco de SPINK3 en una preparación de proteínas de membrana espermática. La fracción de proteínas retenidas por la columna se analizó por SDS-PAGE y zimografía en presencia o ausencia de SPINK3-His6, una versión de la proteína recombinante que mantiene su actividad inhibitoria de tripsina. Los resultados del SDS-PAGE muestran dos bandas de aproximadamente 68 y 54 kDa que fueron retenidas por la columna cuya identidad está siendo analizada. La zimografía mostró dos bandas que poseen actividad proteolítica no-inhibible por SPINK3-His6. Estos resultados confirman que SPINK3 se une a través de interacciones proteína-proteína a la superficie espermática y que esta unión no es dependiente de su capacidad inhibitoria.